Este protocolo propuso un modelo de epilepsia con la amígdala como origen. Prepara el camino para la investigación de las estructuras del lóbulo temporal mesial. Este modelo podría interpretarse como la base del experimento.
Como este protocolo es un método de bajo costo y eficiente por lo que se puede llevar a cabo rápidamente en la mayoría de los laboratorios. Demostrando el procedimiento estará Yongchang Lu, un postgraduado en nuestro laboratorio. Comience reuniendo los componentes preparados previamente comenzando con piezas de alambre de tungsteno recubierto de teflón de dos centímetros de largo con un diámetro de oso de 76.2 micrómetros.
Una pieza de alambre de plata con un diámetro de oso de 127 micrómetros de la misma longitud y un juego de pasadores de cuerda calibrados de dos por dos. Use un encendedor para quemar un extremo de cada alambre de tungsteno para eliminar cinco milímetros del revestimiento aislante. Pele una sección de alambre multihilo ultrafino.
Desenvuelva desde la parte inferior hasta el extremo superior donde comienza a oscurecer continuando hacia la parte superior. Combine este alambre súper fino y el alambre de tungsteno pellizcando un extremo y girando suavemente el otro, permitiendo que los dos materiales se entrelazen fácilmente. Tire suavemente para asegurarse de que los cables estén bien envueltos y corte el exceso de alambre súper fino.
Trate de mantener el alambre de tungsteno recto durante todo el proceso. Fije el pasador de cuerda a la abrazadera de la mesa de soldadura con el lado más largo de los pasadores hacia afuera. Use la aguja de la jeringa para recoger un poco de pasta de soldadura y aplíquela a los alfileres.
Caliente la antorcha de soldadura a 320 grados centígrados. Derrita y unte un poco de alambre de estaño sin plomo con la punta de la antorcha. Superponga el extremo superior del alambre de tungsteno con una aguja de los pasadores de la cuerda y use la soldadura en la antorcha para unir el alambre de tungsteno al pasador.
Suelde otro alambre de tungsteno y otro alambre de plata al pasador de cuerda de la misma manera para que cada cable corresponda a una aguja. Corte dos tubos termorretráctiles ligeramente más largos que el extremo superior del alambre de tungsteno. Colóquelos en la junta de soldadura de dos cables de tungsteno asegurándose de que la parte conductora esté completamente cubierta en el tubo para que el circuito de los dos cables de tungsteno no se coloque en serie.
Retire el electrodo de la abrazadera de la mesa de soldadura y sostenga el electrodo suavemente con alicates grandes, ya que es fácil que los electrodos pierdan su forma al calentar el tubo retráctil. Utilice una buena abrazadera de conductividad térmica con un poco más de fuerza. Encienda el conducto de aire y caliente hasta alcanzar una temperatura de 320 grados centígrados.
Sople el tubo termorretráctil durante varios segundos hasta que esté apretado. Refuerce el electrodo con adhesivo termofusible. Sostenga los dos alambres de tungsteno y gírelos juntos, manteniendo sus extremos separados.
Recorte los alambres de tungsteno trenzados a aproximadamente 10 milímetros de longitud para que la separación en los extremos no exceda los 0,5 milímetros. Verifique los electrodos con un multímetro colocando una barra del multímetro en el lado sin soldadura de los pasadores de la cuerda y tocando suavemente el extremo del alambre de tungsteno o alambre de plata con la otra barra. Comprobar si el circuito es liso.
Asegúrese de que las líneas no se colocan en serie. Despegue cinco milímetros de la piel de aislamiento en cada extremo para exponer el cable de metal en el interior. Agregue una sección de tubo termorretráctil a cada cable de arranque.
Suelde cada cable con el enchufe del conector del dispositivo EEG. Encoge el tubo termorretráctil con aire caliente. Agregue una sección de tubo termorretráctil a cada cable del rotor.
Atornille las partes conductoras de los cables rojo y naranja y suéldelas a una junta y al cabezal para que encajen en el pasador de la cuerda. Suelde los otros dos cables del cabezal a cada unión. Pesa el ratón.
Cuando el ratón esté completamente anestesiado, afeite el pelo desde el ojo hasta el área de la oreja con una navaja de afeitar. Fije el ratón en el marco estereotáxico. Coloque los dientes superiores frontales en la barra incisiva e inserte ambas barras auriculares a profundidades iguales en las orejas.
Aplique ungüento oftálmico de eritromicina en los ojos para prevenir la sequedad y la ceguera causadas por la luz brillante durante la cirugía. Desinfecte el área quirúrgica al menos tres veces con hisopos alternos de yodóforo y alcohol al 75%. Haga una incisión longitudinal para exponer completamente el área quirúrgica o haga una incisión triangular siempre que exponga las fontanelas anteriores y posteriores y los sitios de implantación de electrodos.
Enrolle un pequeño trozo de algodón en una bola y humedézcalo con peróxido de hidrógeno al 3%. Retire el tejido blando adherido al cráneo frotando suavemente el área expuesta con una pequeña bola de algodón hasta que se vean las fontanelas anterior y posterior. Ajuste las alturas anterior y posterior para que la fontanela anterior y posterior queden horizontales.
Considere que la posición de la fontanela anterior es el origen de los ejes. Fije un tornillo de acero inoxidable al cráneo cerebeloso izquierdo. Establezca las coordenadas para la activación de la amígdala desde el bregma y ajuste el dispositivo estereotáxico para localizar este punto y marcarlo.
Perfore un agujero en el punto de marcha con un taladro de cráneo de 0,5 milímetros de diámetro. Fije los electrodos a la varilla de localización del dispositivo estereotáxico. Coloque el electrodo verticalmente sobre el orificio y deje caer la posición a menos 4,9 milímetros lentamente.
Envuelva el alambre plateado alrededor del tornillo tres veces. Teniendo cuidado de no sacudir el cuerpo del electrodo durante la operación. Mezcle el cemento dental y aplíquelo suavemente sobre el electrodo y la superficie del cráneo.
Cuando el cemento dental se endurezca, modifique el exterior hasta que el cemento que encierra el electrodo fijo se convierta en un cono. Luego suelte el electrodo del dispositivo estereotáxico. Retire el ratón y colóquelo de nuevo en la jaula.
Manteniéndolo separado de los otros ratones. Coloque el mouse en una caja personalizada con cables deslizantes que conecten el electrodo en la cabeza del mouse y el dispositivo EEG. Pase el cable a través de un orificio en la tapa de la caja y ajuste la longitud que queda en la caja para permitir que el mouse se mueva libremente.
Encienda el dispositivo EEG y asegúrese de que funciona correctamente. Ajuste los parámetros del estimulador para entregar pulsos de onda cuadrada monofásica de un milisegundo a 60 hercios durante una duración del tren de un segundo durante 10 ciclos de estimulación. Comience con una intensidad de corriente de 50 microamperios para la primera estimulación.
Controle el EEG para después de la descarga caracterizada por picos de alta frecuencia. Si no se observa después de la descarga, agregue 25 microamperios al siguiente estímulo y continúe este proceso cada 10 minutos hasta que se observe una descarga posterior y dure cinco segundos. Estimule el ratón con la intensidad de corriente determinada cada 15 minutos, no más de 20 veces al día.
Monitoree las respuestas conductuales al estímulo. La cirugía de implantación de electrodos se realizó en seis ratones adultos sanos machos C57 negro 6 y la estimulación eléctrica se realizó dos semanas después de la cirugía. El nivel de convulsiones conductuales aumentó gradualmente con el aumento del número de estímulos y se registró el número de estímulos necesarios para la activación completa.
El EEG después de las descargas duró de cinco a 15 segundos. Luego, las descargas espontáneas intracraneales se intensificaron y comenzaron los síntomas conductuales. La duración de las convulsiones fue generalmente inferior a un minuto, lo que reduce el riesgo de muerte por convulsiones graves que resultan en apnea.
La expresión de c-Fos en el tejido cerebral se detectó mediante inmunohistoquímica dos horas después del encendido completo. Los resultados muestran que la expresión de c-Fos en la amígdala ipsilateral aumentó significativamente verificando la viabilidad de este modelo. La separación de los extremos del alambre de tungsteno no debe exceder los medios milímetros, de lo contrario no atravesará el agujero del cerebro.
La longitud del electrodo no debe ser demasiado larga, de lo contrario afectará la actividad de los ratones.
