이 프로토콜은 편도체를 기원으로 하는 간질 모델을 제안했습니다. 그것은 근심 측두엽 구조를 조사하는 길을 열어줍니다. 이 모델은 실험의 기초로 해석 될 수 있습니다.
이 프로토콜은 저렴하고 효율적인 방법이므로 대부분의 실험실에서 신속하게 수행 할 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 것은 우리 연구실의 대학원생 인 Yongchang Lu가 될 것입니다. 곰 직경이 76.2 마이크로 미터 인 테프론 코팅 텅스텐 와이어 2cm 길이로 시작하여 미리 준비된 구성 요소를 수집하는 것으로 시작하십시오.
같은 길이의 곰 직경이 127마이크로미터인 은선 1개와 2x2개의 게이지 로프 핀 1세트. 라이터를 사용하여 각 텅스텐 와이어의 한쪽 끝을 태워 절연 코팅의 5mm를 제거합니다. 초미세 다중 가닥 와이어 부분을 벗겨냅니다.
어두워지기 시작하는 아래쪽에서 위쪽 끝까지 포장을 풀고 위쪽으로 계속 이동합니다. 이 초미세 와이어와 텅스텐 와이어를 한쪽 끝을 꼬집고 다른 쪽 끝을 부드럽게 비틀어 결합하여 두 재료를 쉽게 얽힐 수 있습니다. 와이어가 단단히 감겨 있는지 확인하고 여분의 초미세 와이어를 잘라내기 위해 부드럽게 당깁니다.
공정 전반에 걸쳐 텅스텐 와이어를 똑바로 유지하십시오. 로프 핀을 cl에 고정amp핀의 긴 면이 바깥쪽을 향하도록 용접 테이블의 경우. 주사기 바늘을 사용하여 솔더 페이스트를 집어 핀에 바릅니다.
용접 토치를 섭씨 320도로 가열합니다. 토치 팁으로 무연 주석 와이어를 녹이고 닦습니다. 텅스텐 와이어의 상단을 로프 핀의 한 바늘과 겹치고 토치의 땜납을 사용하여 텅스텐 와이어를 핀에 접착합니다.
다른 텅스텐 와이어와 다른 은선을 같은 방법으로 로프 핀에 용접하여 각 와이어가 바늘에 해당하도록합니다. 두 개의 열수축 튜브를 텅스텐 와이어의 상단보다 약간 길게 자릅니다. 두 개의 텅스텐 와이어의 회로가 직렬로 배치되지 않도록 전도성 부분이 튜브에 완전히 덮여 있는지 확인하기 위해 두 개의 텅스텐 와이어의 솔더 조인트에 놓습니다.
용접 테이블 클램프에서 전극을 제거하고 수축 튜브를 가열할 때 전극의 모양이 사라지기 쉽기 때문에 큰 펜치로 전극을 부드럽게 잡습니다. 좋은 열전도율 cl을 사용하십시오.amp 약간 더 많은 힘으로. 공기 덕트를 켜고 섭씨 320도의 온도에 도달할 때까지 가열합니다.
열수축 튜브가 조여질 때까지 몇 초 동안 불어줍니다. 핫멜트 접착제로 전극을 강화하십시오. 두 개의 텅스텐 와이어를 잡고 끝을 벌리면서 함께 비틀어 놓습니다.
꼬인 텅스텐 와이어를 약 10mm 길이로 잘라서 끝 부분의 간격이 0.5mm를 초과하지 않도록합니다. 로프 핀의 용접되지 않은 쪽에 멀티 미터의 한 막대를 놓고 텅스텐 와이어 또는 은색 와이어의 끝을 다른 막대에 부드럽게 접촉하여 멀티 미터로 전극을 확인합니다. 회로가 매끄러운지 확인합니다.
선이 직렬로 배치되지 않았는지 확인하십시오. 양쪽 끝에서 절연 스킨 5mm를 벗겨 내면의 금속 와이어가 노출됩니다. 각 스타터 와이어에 열수축 튜브 섹션을 추가합니다.
EEG 장치 커넥터 플러그로 각 와이어를 용접합니다. 열수축 튜브를 뜨거운 공기로 수축시킵니다. 각 로터 와이어에 열수축 튜브 섹션을 추가합니다.
빨간색과 주황색 와이어의 전도성 부분을 함께 나사로 고정하고 로프 핀에 맞도록 조인트와 헤더에 용접합니다. 헤더의 다른 두 와이어를 각 조인트에 용접합니다. 마우스의 무게를 잰다.
마우스가 완전히 마취되면 면도기로 눈에서 귀 부분까지 머리카락을 면도하십시오. 스테레오탁스 프레임에 마우스를 고정하십시오. 앞니를 앞니에 넣고 양쪽 이어바를 귀에 같은 깊이로 삽입합니다.
에리스로마이신 눈 연고를 눈에 바르면 수술 중 밝은 빛으로 인한 건조와 실명을 예방할 수 있습니다. iodophor와 75 % 알코올의 면봉을 번갈아 가며 수술 부위를 최소 3 회 소독하십시오. 수술 부위를 완전히 노출시키기 위해 세로 절개를 하거나 전방 및 후방 천문과 전극 이식 부위를 노출시키는 한 삼각형 절개를 합니다.
작은 면봉을 동그랗게 말아서 3% 과산화수소로 적십니다. 전방 및 후방 천문이 보일 때까지 노출된 부위를 작은 면봉으로 부드럽게 문질러 두개골에 부착된 연조직을 제거합니다. 전방 및 후방 천문이 수평이 되도록 전방 및 후방 높이를 조정합니다.
앞쪽 천문의 위치를 축의 원점으로 생각하십시오. 왼쪽 소뇌 두개골에 스테인리스 스틸 나사를 고정합니다. 브레그마에서 편도체 점화의 좌표를 설정하고 정위 장치를 조정하여 이 지점을 찾아 표시합니다.
0.5mm 직경의 해골 드릴로 행진 지점에 구멍을 뚫습니다. 전극을 정위 장치의 위치 지정 막대에 고정합니다. 전극을 구멍 위에 수직으로 놓고 천천히 마이너스 4.9mm까지 떨어뜨립니다.
은선을 나사에 세 번 감습니다. 작동 중 전극 본체가 흔들리지 않도록 주의하십시오. 치과용 시멘트를 혼합하여 전극과 두개골 표면에 부드럽게 도포합니다.
치과용 시멘트가 굳으면 고정전극을 둘러싸고 있는 시멘트가 원뿔형이 될 때까지 외부를 개질한다. 그런 다음 입체 장치에서 전극을 분리합니다. 마우스를 제거하고 케이지에 다시 넣습니다.
다른 생쥐와 분리하여 유지합니다. 마우스 머리의 전극과 EEG 장치를 연결하는 슬리퍼 케이블이 있는 맞춤형 상자에 마우스를 넣습니다. 상자 뚜껑의 구멍을 통해 케이블을 연결하고 마우스가 자유롭게 움직일 수 있도록 상자에 남아 있는 길이를 조정합니다.
EEG 장치를 켜고 올바르게 작동하는지 확인하십시오. 10개의 자극 주기 동안 1초 동안 60Hz에서 1밀리초의 단상 구형파 펄스를 전달하도록 자극기 파라미터를 설정합니다. 첫 번째 자극을 위해 50마이크로암페어의 전류 강도로 시작합니다.
고주파 스파이크를 특징으로 하는 방전 후 EEG를 모니터링합니다. 방전 후 관찰되지 않으면 다음 자극에 25 마이크로 암페어를 추가하고 방전 후가 관찰되고 5 초 동안 지속될 때까지 10 분마다이 과정을 계속하십시오. 결정된 전류 강도로 마우스를 15분마다, 하루에 20번 이상 자극하지 마십시오.
자극에 대한 행동 반응을 모니터링하십시오. 전극 이식 수술은 6 명의 건강한 성인 남성 C57 검정 6 마리의 마우스에 수행되었으며 전기 자극은 수술 후 2 주 후에 수행되었습니다. 행동 발작 수준은 자극의 수가 증가함에 따라 점차 증가했으며 완전한 점화에 필요한 자극의 수가 기록되었습니다.
방전 후 EEG는 5-15초 동안 지속되었습니다. 그런 다음 두개 내 자연 분비물이 심화되고 행동 증상이 시작되었습니다. 발작 지속 시간은 일반적으로 1분 미만으로 무호흡을 유발하는 심한 경련으로 인한 사망 위험을 줄였습니다.
뇌 조직에서 c-Fos의 발현은 완전 점화 2시간 후 면역조직화학에 의해 검출되었습니다. 결과는 동측 편도체에서 c-Fos의 발현이 크게 증가하여 이 모델의 타당성을 입증하는 것을 보여줍니다. 텅스텐 와이어 끝의 분리는 반 밀리미터를 초과해서는 안되며, 그렇지 않으면 뇌 구멍을 통과하지 않습니다.
전극의 길이가 너무 길어서는 안되며, 그렇지 않으면 생쥐의 활동에 영향을 미칩니다.
