このプロトコルは、扁桃体を起源とするてんかんのモデルを提案しました。それは近心側頭葉構造の調査への道を開きます。このモデルは実験の基礎として解釈することができます。
このプロトコルは低コストで効率的な方法であるため、ほとんどのラボで迅速に実行できます。手順を実演するのは、私たちの研究室の大学院生であるヨンチャン・ルーです。ベア直径76.2マイクロメートルのテフロンコーティングされた2センチの長さのタングステン線から始めて、事前に準備されたコンポーネントを集めることから始めます。
同じ長さのベア直径127マイクロメートルの銀線1本と、2×2ゲージのロープピン1セット。ライターを使用して各タングステンワイヤーの一端を燃やし、5ミリメートルの絶縁コーティングを取り除きます。極細マルチストランド線の一部をはがします。
下端から上端に向かって展開し、暗くなり始め、上に向かって続きます。この極細線とタングステン線を合わせ、一方の端をつまんでもう一方の端をそっとねじることで、2つの材料を簡単に絡み合わせることができます。ワイヤーがしっかりと包まれていることを確認するためにゆっくりと引っ張り、余分な極細ワイヤーを切り取ります。
プロセス全体を通してタングステン線をまっすぐに保つようにしてください。ロープピンをクランプに固定しますamp ピンの長辺を外側に向けて溶接テーブル。シリンジ針を使用してはんだペーストを拾い上げ、ピンに塗布します。
溶接トーチを摂氏320度に加熱します。トーチチップで鉛フリーのブリキ線を溶かして塗ります。タングステン線の上端をロープピンの1本の針で重ね、トーチのはんだを使用してタングステン線をピンに接着します。
別のタングステン線と別の銀線を同じ方法でロープピンに溶接し、各ワイヤーが針に対応するようにします。タングステン線の上端より少し長い2本の熱収縮チューブを切断します。2本のタングステンワイヤの回路が直列に配置されないように、導電性部分がチューブで完全に覆われるように、それらを2本のタングステンワイヤのはんだ接合部に置きます。
溶接テーブルクランプから電極を取り外し、収縮チューブを加熱すると電極の形状が崩れやすいため、大きなペンチで電極をそっと保持します。少し力の強い優れた熱伝導率クランプを使用してください。エアダクトをオンにし、摂氏320度の温度に達するまで加熱します。
熱収縮チューブが締められるまで数秒間吹きます。ホットメルト接着剤で電極を補強します。2本のタングステン線を持ち、両端を離して撚り合わせます。
両端の間隔が0.5ミリメートルを超えないように、撚り合わせたタングステン線を長さ約10ミリメートルにトリミングします。マルチメーターの1本のバーをロープピンの溶接されていない側に置き、タングステン線または銀線の端をもう一方のバーにそっと触れて、マルチメーターで電極を確認します。回路がスムーズかどうかを確認します。
線が直列に配置されていないことを確認します。両端の絶縁スキンを5ミリ剥がし、内部の金属線を露出させます。各スターターワイヤーに熱収縮チューブのセクションを追加します。
各ワイヤをEEGデバイスコネクタプラグで溶接します。熱風で熱収縮チューブを収縮させます。各ローターワイヤーに熱収縮チューブのセクションを追加します。
赤とオレンジのワイヤーの導電部分をねじ込み、ロープピンに合うようにジョイントとヘッダーに溶接します。ヘッダーの他の2本のワイヤを各ジョイントに溶接します。マウスの重量を量ります。
マウスが完全に麻酔をかけられたら、かみそりで目から耳の部分まで髪を剃ります。脳定位固定装置フレームにマウスを固定します。前歯を切歯バーに入れ、両方のイヤーバーを耳に等しい深さまで挿入します。
エリスロマイシン眼軟膏を目に塗り、手術中の明るい光によって引き起こされる乾燥や失明を防ぎます。ヨードフォアと75%アルコールの交互の綿棒で手術部位を少なくとも3回消毒します。縦切開を行って手術領域を完全に露出させるか、前後の泉門と電極移植部位を露出させる限り三角形の切開を行います。
綿の小片をボールに丸め、3%過酸化水素で濡らします。前部と後部の泉門が見えるまで、露出した部分を小さな綿球でそっとこすって、頭蓋骨に付着した軟組織を取り除きます。前部と後部の泉門が水平になるように、前後の高さを調整します。
前泉門の位置を軸の原点と考えてください。左小脳頭蓋骨にステンレス鋼のネジを固定します。ブレグマから扁桃体のキンドリングの座標を設定し、定位固定装置を調整してこの場所を見つけてマークします。
直径0.5ミリメートルの頭蓋骨ドリルで行進スポットに穴を開けます。電極を定位固定装置の位置決めロッドに固定します。電極を穴の上に垂直に置き、位置をゆっくりとマイナス4.9ミリメートルに落とします。
銀線をネジに3回巻き付けます。動作中に電極体を振らないように注意してください。歯科用セメントを混合し、電極と頭蓋骨の表面にそっと塗布します。
歯科用セメントが硬化したら、固定電極を囲むセメントが円錐形になるまで外側を修正します。次に、電極を定位固定装置から解放します。マウスを取り外し、ケージに戻します。
他のマウスから分離しておきます。マウスの頭の電極とEEGデバイスを接続するスリッパケーブル付きのカスタマイズされたボックスにマウスを入れます。ケーブルを箱の蓋の穴に通し、箱に残っている長さを調整して、マウスが自由に動くようにします。
EEGデバイスの電源を入れ、正しく機能することを確認します。刺激器パラメータを設定して、60ヘルツで1ミリ秒の単相方形波パルスを10回の刺激サイクルで1秒間のトレーニング持続時間で配信します。最初の刺激のために50マイクロアンペアの電流強度から始めます。
高周波スパイクを特徴とする放電後のEEGを監視します。放電後に観察されない場合は、次の刺激に25マイクロアンペアを追加し、放電後が観察されて5秒間続くまで、10分ごとにこのプロセスを続けます。決定された電流強度でマウスを15分ごとに、1日20回以下刺激する。
刺激に対する行動反応を監視します。電極移植手術は健常成人男性C57ブラック6匹のマウスに行い、電気刺激は術後2週間で行った。行動発作レベルは刺激数の増加とともに徐々に増加し、完全なキンドリングに必要な刺激の数が記録されました。
退院後の脳波は5〜15秒続いた。その後、頭蓋内の自然放電が激しくなり、行動症状が始まりました。発作時間は通常1分未満であり、無呼吸を引き起こす重度のけいれんによる死亡のリスクを軽減します。
脳組織におけるc-Fosの発現は、完全なキンドリングの2時間後に免疫組織化学によって検出されました。結果は、同側扁桃体におけるc-Fosの発現が有意に増加したことを示しており、このモデルの実現可能性を検証しています。タングステンワイヤーの端の分離は半ミリメートルを超えてはなりません、さもなければそれは脳の穴を通過しません。
電極の長さは長すぎてはいけません、さもなければそれはマウスの活動に影響を与えます。
