В этом протоколе была предложена модель эпилепсии с миндалевидным телом в качестве источника. Это открывает путь к исследованию мезиальных структур височной доли. Эта модель может быть интерпретирована как основа эксперимента.
Поскольку этот протокол является недорогим и эффективным методом, он может быть быстро выполнен в большинстве лабораторий. Продемонстрирует процедуру Юнчан Лу, аспирант нашей лаборатории. Начните со сбора заранее подготовленных компонентов, начиная с двухсантиметровых кусков вольфрамовой проволоки с тефлоновым покрытием и диаметром подшипника 76,2 микрометра.
Один кусок серебряной проволоки с диаметром медведя 127 микрометров одинаковой длины и один набор из двух на два калиброванных веревочных штифта. Используйте зажигалку, чтобы сжечь один конец каждой вольфрамовой проволоки, чтобы удалить пять миллиметров изоляционного покрытия. Отсоедините отрезок ультратонкой многожильной проволоки.
Разверните снизу к верхнему концу, где начинает темнеть, продолжая движение вверх. Объедините эту сверхтонкую проволоку и вольфрамовую проволоку, зажав один конец и осторожно скрутив другой, что позволит двум материалам легко переплетаться вместе. Осторожно потяните, чтобы провода были плотно обмотаны, и отрежьте лишнюю сверхтонкую проволоку.
Старайтесь, чтобы вольфрамовая проволока была прямой на протяжении всего процесса. Закрепите тросовый штифт на зажиме на сварочном столе более длинной стороной штифтов наружу. Используйте иглу шприца, чтобы набрать немного паяльной пасты и нанести ее на штифты.
Нагрейте сварочную горелку до 320 градусов Цельсия. Расплавьте и намажьте наконечником горелки бессвинцовую оловянную проволоку. Перекройте верхний конец вольфрамовой проволоки одной иглой веревочных штифтов и используйте припой на горелке, чтобы прикрепить вольфрамовую проволоку к штифту.
Таким же образом приварите к веревочному штифту еще одну вольфрамовую проволоку и еще одну серебряную проволоку так, чтобы каждая проволока соответствовала игле. Отрежьте две термоусадочные трубки чуть длиннее верхнего конца вольфрамовой проволоки. Поместите их на паяное соединение двух вольфрамовых проводов, убедившись, что проводящая часть полностью покрыта трубкой, чтобы цепь двух вольфрамовых проводов не была размещена последовательно.
Снимите электрод с зажима сварочного стола и осторожно удерживайте электрод большими плоскогубцами, так как электроды легко теряют свою форму при нагревании термоусадочной трубки. Используйте зажим с хорошей теплопроводностью с немного большим усилием. Включите воздуховод и нагревайте до тех пор, пока не будет достигнута температура 320 градусов по Цельсию.
Продуйте термоусадочную трубку в течение нескольких секунд, пока она не затянется. Укрепите электрод клеем-расплавом. Возьмитесь за две вольфрамовые проволоки и скрутите их вместе, держа их концы друг от друга.
Обрежьте скрученные вольфрамовые провода примерно до 10 миллиметров в длину так, чтобы расстояние на концах не превышало 0,5 миллиметра. Проверьте электроды мультиметром, поместив один стержень мультиметра на несваренную сторону штифтов каната и осторожно прикоснувшись концом вольфрамовой проволоки или серебряной проволоки к другому стержню. Проверка плавности цепи.
Следите за тем, чтобы линии не располагались последовательно. Снимите по пять миллиметров изоляционной оболочки с каждого конца, чтобы обнажить металлическую проволоку внутри. Добавьте отрезок термоусадочной трубки к каждому стартовому проводу.
Приварите каждый провод к штекеру разъема устройства ЭЭГ. Сожмите термоусадочную трубку горячим воздухом. Добавьте отрезок термоусадочной трубки к каждому проводу ротора.
Прикрутите проводящие части красного и оранжевого проводов вместе и приварите их к стыку и коллектору, чтобы они соответствовали тросовому штифту. Приварите два других провода на коллекторе к каждому стыку. Взвесьте мышь.
Когда мышь полностью обезболит, сбрейте бритвой волосы от глаз до ушей. Зафиксируйте мышь на стереотаксической рамке. Вставьте передние верхние зубы в резцовую планку и вставьте обе ушные планки на одинаковую глубину в уши.
Нанесите эритромициновую глазную мазь на глаза, чтобы предотвратить сухость и слепоту, вызванные ярким светом во время операции. Продезинфицируйте операционную область не менее трех раз чередующимися тампонами йодофора и 75%-ного спирта. Сделайте продольный разрез, чтобы полностью обнажить операционную область, или сделайте треугольный разрез, если он обнажает передние и задние роднички и места имплантации электродов.
Скатайте небольшой кусочек ваты в шарик и смочите его 3%-ной перекисью водорода. Удалите мягкие ткани, прикрепленные к черепу, осторожно потерев открытую область небольшим ватным тампоном, пока не будут видны передний и задний родничок. Отрегулируйте переднюю и заднюю высоту так, чтобы передний и задний родничок были горизонтальными.
Считайте, что положение переднего родничка является началом осей. Закрепите винт из нержавеющей стали на левом черепе мозжечка. Установите координаты для растопки миндалевидного тела от брегмы и настройте стереотаксическое устройство, чтобы найти это место и отметить его.
Просверлите отверстие на месте марша сверлом черепа диаметром 0,5 миллиметра. Закрепите электроды на установочном стержне стереотаксического устройства. Поместите электрод вертикально над отверстием и медленно опустите положение до минус 4,9 миллиметра.
Трижды оберните серебряную проволоку вокруг винта. Следите за тем, чтобы корпус электрода не трясся во время работы. Смешайте зубной цемент и аккуратно нанесите его на электрод и поверхность черепа.
Когда зубной цемент затвердеет, модифицируйте его снаружи до тех пор, пока цемент, окружающий неподвижный электрод, не превратится в конус. Затем отпустите электрод от стереотаксического устройства. Извлеките мышь и поместите ее обратно в клетку.
Держите его отдельно от других мышей. Поместите мышь в индивидуальную коробку с скользящими кабелями, соединяющими электрод на голове мыши и устройство ЭЭГ. Пропустите кабель через отверстие в крышке коробки и отрегулируйте длину, оставшуюся в коробке, чтобы мышь могла свободно двигаться.
Включите устройство ЭЭГ и убедитесь, что оно работает правильно. Установите параметры стимулятора таким образом, чтобы он выдавал одномиллисекундные монофазные прямоугольные импульсы с частотой 60 герц в течение одной секунды в течение 10 циклов стимуляции. Начните с силы тока 50 микроампер для первой стимуляции.
Следите за ЭЭГ после выписки, характеризующейся высокочастотными всплесками. Если после разряда не наблюдается, добавьте 25 микроампер к следующему стимулу и продолжайте этот процесс каждые 10 минут до тех пор, пока не наступит послеразрядный разряд, который продлится пять секунд. Стимулируйте мышь определенной интенсивностью тока каждые 15 минут, не более 20 раз в день.
Следите за поведенческими реакциями на стимул. Операция по имплантации электродов была проведена шести здоровым взрослым самцам C57 черных мышей 6, а электростимуляция была проведена через две недели после операции. Уровень поведенческих припадков постепенно увеличивался с увеличением количества стимулов и регистрировалось количество стимулов, необходимых для полного растопки.
ЭЭГ после разрядов длилась от пяти до 15 секунд. Затем интракраниальные спонтанные выделения усилились и начались поведенческие симптомы. Продолжительность припадка обычно составляла менее одной минуты, что снижает риск смерти от сильных судорог, приводящих к апноэ.
Экспрессия c-Fos в мозговой ткани была обнаружена с помощью иммуногистохимии через два часа после полного растопки. Результаты показывают, что экспрессия c-Fos в ипсилатеральной миндалине значительно увеличилась, что подтверждает осуществимость этой модели. Расстояние между концами вольфрамовой проволоки не должно превышать полумиллиметров, иначе она не попадет через отверстие мозга.
Длина электрода не должна быть слишком большой, иначе это повлияет на активность мышей.
