ATAC-seq nos permite identificar el estado de las regiones abiertas de cromatina en el genoma, que a menudo se altera en los estados de enfermedad en comparación con la condición normal. Menos entrada celular, un protocolo simplificado de digestión Tn5, seguido de aislamiento de ADN fragmentado y preparación de bibliotecas mediante amplificación por PCR y un tiempo experimental más corto lo convierten en una técnica más ventajosa. La comparación del paisaje epigenético alterado por ATAC-seq entre condiciones normales y de enfermedad puede arrojar luz sobre los elementos reguladores de la cromatina asociados a la enfermedad y ser útil para diseñar nuevas estrategias terapéuticas.
Esta técnica es fácil de realizar, ya que no incluye ningún paso experimental crítico. Para obtener resultados ATAC-seq exitosos, solo requiere un par de pasos de estandarización. Para comenzar, transfiera 25 microlitros de una suspensión celular que contenga un millón de células por mililitro en PBS al tubo de microcentrífuga de 1.7 mililitros y centrifugar a 500 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.
Deseche cuidadosamente el sobrenadante y agregue 25 microlitros de tampón de lisis. Vuelva a suspender las células pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo, e incube en hielo durante cinco minutos. Centrifugar a 500 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados, y desechar cuidadosamente el sobrenadante.
Vuelva a suspender inmediatamente el pellet en 25 microlitros de mezcla de reacción Tn5 e incube durante 30 minutos a 37 grados centígrados. Mezclar la solución cada 10 minutos. Agregue cinco microlitros de acetato de sodio 3-molar y 125 microlitros de PB tampón a la solución de ADN marcada con Tn5.
Mezclar bien. A continuación, coloque la columna de centrifugado en un tubo de recolección de 2 mililitros y aplique la muestra a la columna de centrifugado. Centrifugar a 17, 900 G durante un minuto a temperatura ambiente, y desechar el flujo continuo.
Agregue un búfer PE a la columna y gire la columna. Vuelva a colocar la columna de centrifugado en el mismo tubo de recolección y centrifugarla durante cinco minutos para secar completamente la membrana. Deseche el flujo y coloque la columna de centrifugación en un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,7 mililitros.
Eluya los fragmentos de ADN con 10 microlitros de tampón EB y deje reposar la columna durante un minuto a temperatura ambiente. Luego centrifugar a 17, 900 G durante un minuto a temperatura ambiente para eluyir el ADN. Configure la reacción de PCR en tubos de PCR de 200 microlitros y realice el Programa de amplificación de PCR Parte uno.
Para QPCR en tiempo real, prepare la mezcla de reacción de PCR agregando cinco microlitros de producto de PCR, 0.75 microlitros de SYBR Gold diluido 1, 000 veces, cinco microlitros de 2X PCR Master Mix y 3.75 microlitros de agua libre de nucleasa. Determine el número requerido de ciclos de PCR adicionales utilizando los parámetros de ejecución. Una vez que se determine el número de ciclo, configure PCR con los ciclos adicionales calculados anteriormente.
A los productos de PCR amplificados, agregue 150 microlitros de perlas e incube durante 15 minutos a temperatura ambiente. Coloque los tubos en un soporte magnético durante cinco minutos y retire con cuidado el sobrenadante. Lave las perlas con 200 microlitros de etanol al 80% y retire el sobrenadante.
Retire el etanol por completo y seque al aire las muestras durante 10 minutos a temperatura ambiente. Finalmente, vuelva a suspender con 50 microlitros de tampón de elución. Coloque el tubo en un soporte magnético, luego transfiera el eluido a un tubo de microcentrífuga fresco de 1.7 mililitros.
Aquí se muestra una comparación de la eficiencia de la lisis celular utilizando azul de tripano. Las células NMuMG se trataron con un tampón hipotónico y tampón CSK y se tiñeron con azul de tripano. Se observó una mayor eficiencia de lisis celular en las células tratadas con CSK.
Las bibliotecas ATAC-seq se prepararon a partir de células de cáncer de mama MDA-MB-231. Después de la amplificación por PCR, los productos de PCR se analizaron en un gel de agarosa al 1,5% TBE 0,5X antes y después de la purificación de perlas. Las imprimaciones se eliminan principalmente mediante la purificación inicial de las perlas.
También están indicados patrones de bandas de ADN de electroforesis en gel de agarosa 1X TAE al 1% y una electroforesis automatizada. SYBR Gold se utilizó para visualizar los fragmentos de ADN que se muestran aquí. Aquí se presenta una pista del navegador del genoma que muestra el locus ERS1.
La cobertura del genoma de los datos ATAC-seq en células T47D se muestra en esta imagen. Se utilizaron imprimaciones de una publicación anterior y sus regiones objetivo se resaltan en amarillo. Aquí se muestra un gráfico de barras que representa el enriquecimiento del amplicón de imprimación en las bibliotecas ATAC-seq.
Las bibliotecas ATAC-seq se prepararon mediante el tampón hipotónico o un tampón CSK. La imagen representativa muestra la visualización del navegador del genoma para la optimización ATAC-seq. Los datos ATAC-seq de la condición de entrada de 25.000 células mostraron el mayor enriquecimiento de fragmentos libres de nucleosomas, mientras que la condición de entrada de 100.000 células presentó los ADN mononucleosómicos más altos.
Aquí se presentan pistas del navegador del genoma que muestran datos ATAC-seq de diferentes números celulares. El análisis de anotación del pico HOMER se representa en esta imagen representativa. HOMER clasificó cada pico como un pico promotor proximal o distal.
El número de opciones de entrada celular del tampón de lisis celular y la concentración de la enzima Tn5 dependiendo del tipo de célula son los parámetros más críticos que deben estandarizarse. Tn5 fusionado con la proteína A en la técnica de corte y tachuela se usa ampliamente para identificar el sitio de unión al ADN para una proteína de interés utilizando anticuerpos específicos para esa proteína de interés.
