ATAC-seq를 사용하면 게놈에서 열린 염색질 영역의 상태를 식별 할 수 있으며, 이는 정상 상태와 비교하여 질병 상태에서 종종 변경됩니다. 더 적은 세포 입력, 단순화된 Tn5 분해 프로토콜, 단편화된 DNA의 분리 및 PCR 증폭에 의한 라이브러리 준비 및 더 짧은 실험 시간은 더 유리한 기술입니다. 정상 상태와 질병 상태 사이의 ATAC-seq에 의한 변화된 후성유전학적 환경의 비교는 질병 관련 염색질 조절 요소를 밝히고 새로운 치료 전략을 설계하는 데 유용할 수 있습니다.
이 기술은 중요한 실험 단계를 포함하지 않으므로 수행하기 쉽습니다. 성공적인 ATAC-seq 결과를 얻으려면 몇 가지 표준화 단계만 거치면 됩니다. 시작하려면 PBS에 밀리리터당 백만 개의 세포를 포함하는 세포 현탁액에서 25마이크로리터를 1.7밀리리터 미세원심분리 튜브로 옮기고 섭씨 4도에서 5분 동안 500G에서 원심분리합니다.
상청액을 조심스럽게 버리고 25 마이크로 리터의 용해 완충액을 첨가하십시오. 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 세포를 다시 부유시키고 얼음 위에서 5분 동안 배양합니다. 섭씨 4도에서 5 분 동안 500G에서 원심 분리하고 상청액을 조심스럽게 폐기하십시오.
펠렛을 25 마이크로리터의 Tn5 반응 혼합물에 즉시 재현탁시키고, 섭씨 37도에서 30분 동안 인큐베이션한다. 10 분마다 용액을 혼합하십시오. 5 마이크로 리터의 3 몰 아세트산 나트륨과 125 마이크로 리터의 완충액 PB를 Tn5 태그 DNA 용액에 첨가하십시오.
잘 섞는다. 다음으로, 스핀 컬럼을 2밀리리터 수집 튜브에 넣고 샘플을 스핀 컬럼에 적용합니다. 실온에서 1분 동안 17, 900 g에서 원심분리하고, 유동을 폐기한다.
PE 버퍼를 열에 추가하고 열을 회전합니다. 스핀 컬럼을 동일한 수집 튜브에 다시 넣고 5분 동안 원심분리하여 멤브레인을 완전히 건조시킵니다. 플로우 스루를 폐기하고 스핀 컬럼을 새 1.7밀리리터 마이크로 원심분리 튜브에 넣습니다.
DNA 단편을 10 마이크로리터의 완충액 EB로 용리시키고, 컬럼을 실온에서 1분 동안 방치한다. 그 후 17, 900 G에서 실온에서 1분 동안 원심분리하여 DNA를 용출시켰다. 200마이크로리터 PCR 튜브에서 PCR 반응을 설정하고 PCR 증폭 프로그램 파트 1을 수행합니다.
실시간 QPCR의 경우, 5마이크로리터의 PCR 산물, 0.75마이크로리터의 1, 000배 희석된 SYBR 골드, 5마이크로리터의 2X PCR 마스터 믹스 및 3.75마이크로리터의 뉴클레아제 없는 물을 첨가하여 PCR 반응 혼합물을 준비합니다. 실행 파라미터를 사용하여 필요한 추가 PCR 주기 수를 결정합니다. 주기 번호가 결정되면 이전에 계산된 추가 주기로 PCR을 설정합니다.
증폭된 PCR 산물에, 150 마이크로리터의 비드를 첨가하고, 실온에서 15분 동안 인큐베이션한다. 튜브를 마그네틱 스탠드에 5 분 동안 놓고 상층액을 조심스럽게 제거하십시오. 비드를 200 마이크로리터의 80% 에탄올로 세척하고, 상청액을 제거한다.
에탄올을 완전히 제거하고 샘플을 실온에서 10분 동안 자연 건조시킨다. 마지막으로, 50 마이크로리터의 용출 완충액으로 재현탁시킨다. 튜브를 마그네틱 스탠드에 놓은 다음 용출액을 새로운 1.7ml 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.
트리판 블루를 사용한 세포 용해 효율의 비교가 여기에 나와 있습니다. NMuMG 세포를 저장성 완충액 및 CSK 완충액으로 처리하고 트리판 블루로 염색하였다. CSK 처리된 세포에서 더 높은 세포 용해 효율이 관찰되었습니다.
ATAC-seq 라이브러리는 MDA-MB-231 유방암 세포로부터 제조하였다. PCR 증폭 후, PCR 산물을 비드 정제 전후의 0.5X TBE, 1.5% 아가로스 겔에서 분석하였다. 프라이머는 대부분 초기 비드 정제에 의해 제거된다.
1X TAE 1%아가로스 겔 전기영동 및 자동 전기영동으로부터의 DNA 밴드 패턴도 표시됩니다. SYBR 골드는 여기에 표시된 DNA 단편을 시각화하는 데 사용되었습니다. ERS1 유전자좌를 보여주는 게놈 브라우저 트랙이 여기에 표시됩니다.
T47D 세포에서 ATAC-seq 데이터의 게놈 커버리지가 이 이미지에 나와 있습니다. 이전 간행물의 프라이머가 사용되었으며 표적 영역은 노란색으로 강조 표시됩니다. ATAC-seq 라이브러리에서 프라이머 앰플리콘 농축을 나타내는 막대 그래프가 여기에 나와 있습니다.
ATAC-seq 라이브러리는 저장성 완충액 또는 CSK 완충액에 의해 제조하였다. 대표 이미지는 ATAC-seq 최적화를 위한 게놈 브라우저 시각화를 보여줍니다. 25, 000 세포 입력 조건의 ATAC-seq 데이터는 뉴 클레오 솜이없는 단편의 가장 높은 농축을 나타 냈으며, 100, 000 세포 입력 조건은 가장 높은 단핵 DNA를 나타 냈습니다.
다른 세포 번호의 ATAC-seq 데이터를 보여주는 게놈 브라우저 트랙이 여기에 표시됩니다. HOMER 피크 주석 분석은 이 대표 이미지에 묘사되어 있습니다. HOMER은 각 피크를 프로모터 근위 또는 원위 피크로 분류했습니다.
세포 용해 완충액의 세포 입력 선택 횟수와 세포 유형에 의존하는 Tn5 효소의 농도는 표준화되어야 하는 가장 중요한 매개변수입니다. 절단 및 압정 기술에서 단백질 A와 융합된 Tn5는 관심 단백질에 특이적인 항체를 사용하여 관심 단백질의 DNA 결합 부위를 식별하는 데 널리 사용됩니다.
