Este protocolo describe métodos para visualizar morfologías de la columna dendrítica y transitorios de calcio en neuronas de C. elegans. Nuestro enfoque debería facilitar los enfoques genéticos para descubrir los determinantes de la morfogénesis y la función de la columna vertebral. Nuestro protocolo presenta espinas dendríticas en las neuronas GABAérgicas.
Las espinas en otras clases de neuronas de C. elegans también se pueden investigar con estos métodos. Nuestro protocolo describe métodos para inmovilizar C.elegans vivos. Es particularmente importante evitar el movimiento de los animales durante la adquisición de imágenes y elegir las configuraciones láser adecuadas para excitar y registrar la actividad neuronal.
Para adquirir imágenes de alta resolución, agregue tres microlitros de solución anestésica y cantidad de 15 a 20 gusanos adultos jóvenes en almohadillas de agarosa al 10%. Luego aplique el cubreobjetos para inmovilizar los gusanos y selle los bordes del cubreobjetos con una mezcla de sellador adhesivo fundido. Para una adquisición de súper resolución, use un microscopio confocal de barrido láser equipado con microscopía de súper resolución.
Adquiera pilas Z utilizando el tamaño de paso recomendado por el software del fabricante. Recopile una serie de secciones ópticas que abarcan el volumen total del proceso ventral Dorsal D o DD. Envíe las pilas Z para el procesamiento de imágenes utilizando el software del fabricante y analice imágenes con una puntuación superior a siete.
Para la adquisición de Nyquist, utilice un microscopio confocal de barrido láser y seleccione el tamaño de píxel óptimo para la longitud de onda de la luz y la apertura numérica de la lente del objetivo. Luego envíe la pila para la deconvolución 3D utilizando un algoritmo automático. Para el análisis de imágenes, utilice un software de procesamiento de imágenes adecuado para crear proyecciones de intensidad máxima de las pilas Z.
Y cuente manualmente las protuberancias en la dendrita DD. Luego determine la longitud de la dendrita DD marcada para calcular la densidad de espinas por 10 micrómetros de dendrita DD. Luego clasifique las espinas como delgadas o de hongo, filopodiosas, rechonchos o ramificadas.
Utilizando técnicas convencionales como la microinyección, se crean gusanos transgénicos que expresan el sensor de calcio GCaMP en las neuronas DD, y Chrimson, una rodopsina de canal desplazada al rojo en las neuronas VA presinápticas. Luego, bajo una campana laminar, prepare todas las placas transretinianas o ATR agregando 300 microlitros de cultivo bacteriano OP50 cultivado durante la noche y 0.25 microlitros de ATR a cada placa de agar nutriente medio de crecimiento de nematodos de 60 milímetros. Luego extienda el cultivo con una varilla de vidrio estéril.
Para placas de control, agregue 300 microlitros de bacterias OP50 y 0.25 microlitros de etanol. Para permitir el crecimiento bacteriano, incubar las placas a temperatura ambiente durante 24 horas, protegidas de la luz ambiental. Para configurar el experimento, coloque cinco larvas de etapa L4 en ATR o placas de control con semillas OP50, e incube las placas en la oscuridad a 23 grados centígrados.
Después de tres días, use un microscopio de disección estéreo para confirmar el desarrollo de la vulva y elija la progenie de la etapa L4 del ATR y las placas de control para obtener imágenes. A continuación, coloque dos microlitros de poliperlas de 0,05 micrómetros en un portaobjetos de microscopio. Y coloque aproximadamente 10 larvas L4 en la solución.
Usando un alambre de platino, agregue un pequeño glóbulo de súper pegamento a la solución. Agite la solución suavemente para generar hebras filamentosas de pegamento. Luego agregue tres microlitros de tampón M9.
Luego aplique un cubreobjetos y selle sus bordes como se demostró anteriormente. Para registrar transitorios de calcio evocados en las espinas dendríticas, use un microscopio confocal de disco giratorio y ajuste la etapa del microscopio para colocar las espinas DD en el plano focal. Luego configure la adquisición de lapso de tiempo para iluminar la muestra con una línea láser de 488 nanómetros en cada cuadro para detectar fluorescencia GCaMP y una línea láser de 561 nanómetros a intervalos periódicos para la excitación Chrimson.
Para imágenes de calcio in vivo, use deconvolución 2D y alineación de imágenes para corregir desviaciones menores del movimiento del gusano durante la adquisición. Luego defina la columna dendrítica DD como la región de interés o ROI. Duplique el ROI y reubique en una región vecina dentro del gusano para recoger la señal de fondo.
Luego, utilizando el software apropiado, exporte las intensidades de GFP a Excel para cada punto de tiempo y reste la fluorescencia de fondo de la fluorescencia del ROI de la columna vertebral. Determine el cambio en la fluorescencia restando la fluorescencia GFP en el marco inmediatamente antes de la excitación de 561 nanómetros o en cero desde cada punto de tiempo después de la excitación o Delta F. Luego divida por F cero para determinar Delta F sobre F cero. Y grafica las trazas normalizadas.
Primero, determine si los datos se distribuyen normalmente mediante una prueba de Shapiro-Wilk. Para los datos que normalmente no se distribuyen, utilice un ANOVA no paramétrico con corrección post-hoc para pruebas múltiples. Alternativamente, para mediciones que muestren distribución normal o gaussiana, realice una prueba de ANOVA paramétrica pareada para cada medición de fluorescencia GCaMP antes y después de cada pulso de 561 nanómetros.
Y corregir para múltiples comparaciones en cada uno de los dos grupos. El etiquetado de espinas dendríticas DD con tres marcadores independientes, mCherry citosólico, MYR: mRuby y LifeAct: GFP produjo una densidad promedio de 3.4 espinas dendríticas DD por 10 micras de dendrita DD en adultos jóvenes de tipo salvaje. El marcador GFP:Utrophin se excluyó de este análisis porque produjo una densidad de columna vertebral significativamente menor, potencialmente debido a las interacciones de la utrofina con el citoesqueleto de actina que impulsa la morfogénesis de la columna vertebral.
El enfoque de imágenes de células vivas confirmó que la morfología delgada en forma de hongo de las espinas DD predomina en el adulto en comparación con formas alternativas de columna vertebral como filopodio, rechoncha y ramificada. La activación de las espinas dendríticas DD se evaluó mediante señalización colinérgica presináptica en gusanos transgénicos que expresan GCaMP en neuronas DD y Chrimson en neuronas VA presinápticas. Se detectaron ráfagas transitorias de señal GCaMP en las espinas DD inmediatamente después de la activación optogenética de Chrimson en neuronas VA presinápticas.
Un experimento de control en ausencia de ATR confirmó que la medida de la señal GCaMP depende de la activación optogenética de Chrimson, que es estrictamente dependiente de ATR. Para visualizar las espinas DD, es mejor imaginar a los animales acostados de lado, como las espinas que sobresalen están en ángulo recto con la trayectoria de la luz. Con este método, los científicos también pueden usar manipulaciones farmacológicas para comprender los mecanismos que impulsan los transitorios de calcio en las espinas DD.
