Este protocolo es para cortar y cultivar secciones de tejido cardíaco durante seis días bajo condiciones fisiológicas que se pueden utilizar para pruebas de toxicidad cardíaca aguda, así como pruebas de eficacia de terapias de insuficiencia cardíaca. Este sistema de cultivo tiene el potencial de convertirse en un potente modelo predictivo humano in situ para pruebas de toxicidad cardíaca aguda que cierra la brecha entre los resultados de las pruebas preclínicas y clínicas. Demostrar los procedimientos será Qinghui Qu, un gerente de laboratorio de nuestro laboratorio.
Para obtener rodajas de tejido cardíaco de cerdo, primero agregue hielo a la chaqueta de enfriamiento del baño de tejido de un vibratome y agregue la solución de Tyrode al baño. Utilice un frasco de plástico de un litro para recoger la escorrentía de hielo derretida de la chaqueta de enfriamiento del baño de tejido y transferir el corazón del cerdo a una bandeja que contenga un litro de solución cardiopléjica fría fresca en un gabinete de bioseguridad. Usa bisturíes estériles retráctiles para diseccionar el corazón para aislar el ventrículo izquierdo y usa cuchillas rectangulares para cortar el ventrículo izquierdo en bloques de uno a dos centímetros de cubo.
Deje a un lado un bloque de tejido para cortar y coloque las piezas de bloque de tejido restantes en un tubo de 50 mililitros de solución fría de Tyrode sobre hielo. Masajee suavemente el bloque de tejido reservado y agregue una o dos gotas de pegamento tisú al soporte de muestra de metal del vibratoma. Pegue un pedazo de bloque de 4%agar con una superficie de aproximadamente un centímetro cuadrado al pegamento y agregue una o dos gotas de pegamento tisú al agar.
Fije el bloqueo cardíaco al lado del epicardium cardíaco del agar hacia abajo con el tejido lo más plano posible contra el soporte y coloque el soporte de tejido con el bloqueo cardíaco en el baño de corte del vibratome. Es crucial pegar el bloqueo cardíaco al agar con el lado del epicardium cardíaco mirando hacia abajo sobre el pegamento del tejido y para asegurarse de que el tejido es lo más plano posible. A continuación, conecte el tubo de oxígeno al baño de corte y la bandeja metálica llena de solución de Tyrode y coloque coladores celulares de 40 micrómetros en la bandeja metálica para recoger las secciones del tejido cardíaco a medida que se cortan en rodajas.
Utilice el software de funcionamiento del vibratomo para ajustar la altura de la hoja y la muestra de modo que la hoja esté cerca de la parte superior del tejido, pero por debajo de los músculos papilares y el líquido está cubriendo el tejido y la hoja. Seleccione avance para ajustar dónde comenzar a cortar el tejido. Presione la rebanada para aumentar la velocidad y utilice la perilla para mover la hoja hacia el borde del tejido.
Presione la rebanada de nuevo para detener y avanzar para desactivar el proceso. A continuación, ajuste los parámetros de corte como se indica y presione la rebanada para comenzar a cortar el tejido. Cuando la hoja llegue al final del tejido, pero antes de que llegue al final del soporte de la muestra, presione la rebanada de nuevo para detener y presione volver para volver a la posición inicial.
Cuando las rodajas alcancen la longitud completa y parezcan ser de buena calidad, utilice una pipeta Pasteur de plástico llena de solución fría de Tyrode para recoger suavemente el tejido del baño usando fórceps y tijeras de resorte para dislocar la rebanada del corazón según sea necesario. Coloque cada rebanada recolectada en un colador de una sola célula en el baño de Tyrode oxigenado y utilice la solución en la pipeta para presionar el tejido sobre la superficie del colador celular. A continuación, coloque una arandela de metal en la parte superior del tejido para sujetarlo.
Después de al menos una hora en solución Tyrode oxigenada, recorte el exterior de cada rebanada para eliminar los bordes irregulares y pegue el extremo de cada rebanada en una pieza de seis milímetros de ancho de cinta de distribución de impresora de poliuretano esterilizado con cables metálicos incrustados. Coloque las rebanadas de corazón apoyadas en placas de seis pocillos que contengan seis mililitros de medio de cultivo por pozo y use fórceps estériles para asegurarse de que el tejido está en el centro del pozo. Tenga cuidado de que la cubierta de la placa no toque el tejido y coloque la placa en la placa de cultivo para que el lado curvo de la cubierta de la placa coincida con el lado angular de la placa y que las esquinas cuadradas se alineen.
Coloque las rodajas en una incubadora de dióxido de carbono de 37 grados Celsius y 5%. Sustituya los sobrenadantes de cultivo por seis mililitros de medio de cultivo fresco oxigenado tres veces al día. Conecte la cubierta al estimulador eléctrico de cultivo celular y ajuste el estimulador para suministrar continuamente 10 voltios de electricidad y una frecuencia de 1,2 hercios a las rebanadas del corazón.
Después de enchufar la estimulación, las rebanadas del corazón comenzarán a latir. Todos los días durante el cambio de medios del mediodía, reemplace la cubierta de la placa de estimulación de la placa de cultivo para evitar la liberación de partículas de grafito tóxicas en el medio de cultivo. Inserte el tapón de espuma blanca donde la cubierta utilizada se conecta al cable para el estimulador eléctrico de cultivo celular para evitar daños por agua en el circuito eléctrico y coloque la cubierta de la placa en un baño de agua autoclave suplementada con 2X antibiótico /antimicótico.
Al día siguiente, descontaminar la cubierta de la placa en un baño de 70% de etanol durante cinco a 15 minutos antes de transferir la cubierta a un baño de agua autoclave fresco complementado con 2X antibiótico / antimicótico durante tres minutos. Después de enjuagar la cubierta de la placa, utilice una toallita limpia sin pelusas pulverizada con etanol para eliminar el agua residual de las piezas de plástico y retire el tapón de espuma blanca. La cubierta está lista para ser colocada de nuevo en la placa de cultivo.
Usando esta nueva configuración de cultivo biomimético como se demostró, la viabilidad de las rodajas de corazón de cerdo se mantuvo durante seis días según lo evaluado por el ensayo MTT. En los primeros seis días, similar a las respuestas observadas para las rebanadas de corazón fresco, no hay transitorios de calcio espontáneos dentro de los cardiomiocitos de la rebanada de corazón del cerdo. Los cardiomiocitos respondieron a la estimulación eléctrica externa y beta-adrenérgica.
Además, la fuerza contráctil y las respuestas al isoproterenol se mantuvieron en el cultivo de la rebanada del corazón durante un máximo de seis días similar a la observada en las rebanadas frescas del corazón. Se pueden realizar varias evaluaciones estructurales y funcionales en las rebanadas cardíacas, incluyendo ensayos de viabilidad de MTT, inmunosu manchado, microscopía electrónica, mediciones transitorias de calcio, evaluaciones de la función contráctil, evaluaciones metabólicas y análisis. Actualmente estamos utilizando este sistema de cultivo para probar la toxicidad cardíaca aguda y la eficacia de fármacos y terapias genéticas de interés en rodajas de cerdo y corazón humano.
