El estudio in vitro y la cinética del aptámero fluorogénico celular permite al usuario evaluar si las interacciones del colorante aptámero son lo suficientemente rápidas como para estudiar un proceso de interés en tiempo real. Las técnicas presentadas permiten realizar mediciones cinéticas cuantitativas tanto dentro como fuera de la célula, cualquiera de las cuales podría ser relevante dependiendo de la aplicación del aptámero. Los métodos presentados se pueden aplicar a cualquier sistema de ARN fluorogénico, incluidos aptámeros alternativos y biosensores basados en ARN para moléculas pequeñas.
Para comenzar, configure el programa de renaturalización de ARN desde el termociclador. Cree el programa seleccionando crear nuevo programa"agregar nueva fase" y agregar nuevo paso"varias veces para agregar pasos específicos de temperatura antes de presionar guardar"Ajuste la configuración adicional de acuerdo con el programa. Para renaturalizar dos espinacas y ARN de brócoli, prepare dos tallos micromolares de cada ARN en agua destilada doble en un tubo de PCR de pared delgada de 0,5 mililitros.
Luego agregue volúmenes iguales de tampón de renaturalización de dos x para hacer una solución de ARN micromolar. Coloque los tubos en el termociclador. Abra el programa de renaturalización guardado y presione ejecutar"A continuación, configure el programa de inyector lector de placas.
En el lector de placas de fluorescencia, seleccione la temperatura y configúrela a 37 grados centígrados. Antes de comenzar la cinética, asegúrese de que la temperatura se haya equilibrado con este valor. Abra el software del lector de placas.
Seleccione configuración"luego vista de adquisición" para ingresar el programa para mediciones cinéticas, seleccione bucle "para cada pozo. A continuación, establezca la configuración de línea base en 60 lecturas de línea base y la configuración de inyección inteligente para la inyección de 10 microlitros. Ajuste las lecturas de fluorescencia de longitud de onda de excitación a 448 nanómetros, longitud de onda de emisión a 506 nanómetros y cartucho a mono.
Establezca el tiempo total de lectura en 10 minutos con un intervalo de lectura de 0,5 segundos. Ajuste PMT y óptica a seis flashes por lectura. Luego ingrese el bucle al siguiente pozo.
Para preparar el inyector lector de placas, seleccione inyectar "en el lector de placas" y suministre una placa de recolección de residuos cuando se le indique. Luego seleccione lavar y limpie el tubo de inyección siguiendo las instrucciones en el lector de placas con volúmenes de un mililitro de agua destilada doble, etanol al 75% y luego agua destilada. A continuación, seleccione aspirado"permitiendo que el inyector expulse el exceso de líquido.
Luego seleccione prime"para cebar el inyector con dos 260 microlitros de 100 micromolares D F H B I.To realizar un experimento cinético, agregue 80 microlitros de mezcla maestra de tampón de unión a un pocillo de una placa inferior transparente de 96 pozos. Luego agregue 10 microlitros de ARN renaturalizado. Deje que la placa y la solución D F H B I en el inyector se equilibren a 37 grados centígrados durante 15 minutos.
A continuación, seleccione el pozo que se analizará en la configuración del software en el área de lectura. Luego, en la pestaña inicio, seleccione ejecutar"para ejecutar el programa cinético descrito anteriormente. Repita este proceso hasta que se completen todos los experimentos.
Después de la carrera, lave el inyector para extraer la solución D F H B I restante del tubo de inyección como se demostró anteriormente. Para configurar los archivos experimentales, encienda el citómetro de flujo y la computadora. Cree un nuevo archivo dentro de la pestaña del explorador de experimentos haciendo clic con el botón derecho en el citómetro de flujo"nombre de usuario.
Luego seleccione nuevo experimento"en la ventana desplegable y cuando aparezca una nueva ventana en la pantalla de la computadora, seleccione el tipo de experimento como tubos"y luego seleccione aceptar"En el nuevo archivo de experimento, haga clic derecho en la carpeta del grupo y seleccione agregar nuevo tubo de muestra"Etiquete los tubos de muestra para cada punto de tiempo específico y replique haciendo clic derecho en la muestra" y seleccionando cambiar nombre" en el menú desplegable. A continuación, prepare una solución celular diluida agregando 1,5 mililitros de un X P B S y tres microlitros de células inducidas en medios de IA en un tubo de cultivo. Antes de agregar tinte, mida la fluorescencia de fondo de las células para observar que el pliegue se activa con el tiempo.
Una vez que se agrega el tinte, coloque el tubo de cultivo que contiene células en P B S en el elevador de tubos de muestra y eleve el elevador a la aguja de inyección de muestra. Luego seleccione el archivo de muestra adecuado dentro de la pestaña del panel de recolección y haga clic en grabar"Una vez que se complete la ejecución, baje el elevador de tubos de muestra con el tubo de cultivo a mano. Para iniciar un paso de enjuague, para enjuagar el sistema fluídico y minimizar el arrastre entre cada muestra de réplica biológica.
Para pasar al siguiente ejemplo, seleccione el siguiente archivo de ejemplo haciendo clic en el icono de flecha derecha cerca del nombre del tubo de ejemplo debajo del icono de registro. Para medir la fluorescencia de las células con colorante, agregue 1,4 microlitros de colorante concentrado en uno X P B S con células, para obtener una concentración final de 50 micromolares D F H B I una T.Asegure la tapa del tubo de cultivo e invierta de tres a cinco veces para mezclar la solución de manera uniforme. A continuación, retire la tapa y coloque el tubo de cultivo en el elevador de tubos de muestra.
Después de levantar el soporte a la aguja de inyección de muestra, haga clic en el icono record"debajo del archivo de muestra adecuado. Luego, comience un temporizador presionando start"In vitro cinética de aptámeros fluorogénicos espinaca dos y brócoli, mostró cinética de asociación bifásica para unirse al colorante D F H B I. Para ambos aptámeros, los datos cinéticos se ajustaron mejor mediante la asociación de dos fases que una fase en tiempos de medición largos.
La curva de mejor ajuste determinó las constantes de velocidad y los valores de vida media para las asociaciones rápidas y lentas. La espinaca dos en el estado de competencia vinculante, mostró un encendido más rápido que el brócoli. La cinética de la segunda fase para ambos aptámeros es similar y puede corresponder a un paso común de limitación de velocidad.
Las curvas cinéticas de los aptámeros están compuestas por un grado similar de ARN de asociación rápida. Para las células que expresan espinaca dos ARN T, la intensidad media de fluorescencia o M F I aumenta inmediatamente en el punto de tiempo cero. Además, la fluorescencia celular alcanzó su valor máximo equilibrado de M F I en cinco minutos.
En contraste, las células de control mostraron baja fluorescencia de fondo y ningún cambio en los valores de M F I con la adición de D M S O Los métodos presentados permiten a los investigadores determinar cómo pueden hacer sensores basados en ARN en aptámeros fluorogénicos más rápido.
