Los diferentes segmentos del oviducto tienen funciones fisiológicas distintas y son diferencialmente susceptibles al cambio patológico. La identificación de los diferentes segmentos en un oviducto de ratón muy pequeño es un desafío, al igual que la producción de un buen rendimiento de células bien diferenciadas por disociación tisular. En este video, demostraremos cómo desenrollar el oviducto del ratón, reconocer los diferentes segmentos para que puedan analizarse individualmente y, finalmente, cómo producir un rendimiento relativamente alto de células disociadas diferenciadas.
Una mejor comprensión del entorno específico de la ampolla puede mejorar las técnicas de fertilización in vitro. Además, al contrastar el infundíbulo con otros segmentos, podemos comprender mejor la propensión del infundíbulo a la transformación maligna. El procedimiento de disociación unicelular libera las células estromales, así como las células epiteliales del oviducto.
Nuestro método también brinda oportunidades para analizar por separado las contribuciones de las células inmunes, lisas y epiteliales a la fisiología y patología del oviducto. Trabajar bajo un microscopio de disección puede ser difícil al principio. Aconsejaría practicar con un tubo más grande como el útero para asegurarse de que sus herramientas sean adecuadas para la microdisección del oviducto.
Comience colocando un trozo de cera dental en una placa de Petri con adhesivo y dejándolo secar. Luego desinfecte el plato con etanol al 70%. La superficie ahora está lista para la disección.
Inmovilice la placa de Petri que contiene la cera dental en la plataforma fría bajo un microscopio de disección cuando esté listo para la disección. Desinfectar la superficie ventral del animal con etanol al 70%. Luego abra la cavidad abdominal y pélvica con tijeras de disección estériles.
Mueva el tracto gastrointestinal hacia un lado para localizar el útero dorsal bihornal. Siga cada cuerno uterino rostralmente para localizar cada oviducto y ovario que están envueltos en la almohadilla de grasa uterina justo debajo del riñón. Luego extirpa ambos oviductos laterales con los ovarios y una porción del cuerno uterino distal aún unido usando tijeras de disección.
Corte cada cuerno uterino lateral con aproximadamente uno o dos centímetros del cuerno aún unido al oviducto en espiral y al ovario. Sumerja el tejido inmediatamente en dos mililitros de medio de disección en frío, luego fije el tejido uterino a la cera dental con una aguja estéril de calibre 25 para asegurar el tejido para la disección. Limpie y diseccione la almohadilla de grasa ovárica y el tejido conectivo para visualizar el oviducto con claridad.
Use una jeringa de un mililitro para dispensar una o dos gotas de solución estéril de colorante azul de toluidina al 1% e incube durante 30 segundos a un minuto. Enjuague con DPBS frío y luego retire todo el líquido. Extraiga ligeramente el ovario del oviducto en espiral.
Corte en la membrana bursal en el ligamento ancho para extraer el ovario del oviducto sin comprometer el tejido tubárico. Localice el extremo fimbrial distal del oviducto que se encuentra lateral a la unión tubárica uterina. Tire suavemente del tubo y corte el mesosalpinx con microcisíjeras en forma de resorte para desenrollar el oviducto.
Cortar el tubo para producir la región infundibular. Luego elimine la región ampular cortando entre las curvas dos y tres. Finalmente, corte la porción restante a la unión tubárica uterina, que es la región ístmica.
Congele inmediatamente los segmentos de tejido disecado en nitrógeno líquido y luego agregue 200 microlitros de reactivo de extracción de ARN en frío y mezcla de perlas de homogeneización uno a uno al tejido para el aislamiento de ARN. Comenzando en la región fimbrial, corte el tubo longitudinalmente con tijeras en forma de resorte y use pinzas como palanca para exponer el epitelio luminal. Picar las porciones abiertas de la hendidura y el oviducto restante en aproximadamente uno o dos segmentos milímetros.
Luego agregue cinco mililitros de tampón de disociación no enzimática caliente al tejido e incube a 37 grados centígrados. Aquí se muestran imágenes fluorescentes y de contraste de fase de un grupo celular positivo para ocludina, núcleos y tubulina acetilada. El rojo denota ocludina, el azul denota núcleos y el verde denota tubulina acetilada.
El borde apical ciliado permanece intacto durante todo el protocolo y resiste una mayor digestión a células individuales. En estas imágenes representativas, se muestran los canales fusionados, rojo, azul, contraste de fase y verde. Después de una breve incubación de pronasas, la mayoría de las células son únicas.
La tinción de yoduro de propidio muestra aproximadamente un 93% de viabilidad en Brightfield, canal rojo PI positivo y fusión. El recuadro en la fusión muestra un borde ciliado intacto en una sola celda disociada. Tales células tienen cilios que golpean activamente.
El ARN entero se evaluó para determinar su rendimiento y calidad mediante espectrofotómetro de microvolumen y bioanalizador. Los resultados muestran que este método produce de 800 a 1.200 nanogramos de ARN por segmento, excepto para muestras infundibulares donde la agrupación de dos animales puede ser necesaria para un rendimiento adecuado para los ensayos posteriores. Los resultados presentados para el infundíbulo se agrupan a partir de dos animales, totalizando cuatro regiones infundibulares.
Este protocolo logra con éxito arn puro analizado con un espectrofotómetro de microvolumen y un bioanalizador. Las muestras tienen una relación de absorción de 260 por 280 nanómetros entre 1,8 y 2, típica de las especies de nucleótidos de ARN puro. El bioanálisis de las muestras mostró una alta integridad de ARN con un número de integridad de ARN evaluado por encima de siete, apropiado para la expresión aguas abajo y el análisis de secuenciación.
Recuerde retener de uno a dos centímetros del cuerno uterino para fijar el sistema tubárico a la plataforma de disección. Además, el uso del tinte azul toluidina ayuda en el rápido desenrollamiento del oviducto. Cuanto más rápido se desenrolle, mejor será la preservación y la menor cantidad de degradación de ARN.
Este método es suficiente para obtener ARN de calidad adecuada para la secuenciación de ARN que permite la secuenciación de segmentos individuales. La disociación celular es apropiada para la secuenciación unicelular o la citometría de flujo, lo que permite un análisis más preciso de segmentos y células. El método ayudará a mover el campo más allá del análisis de tubo completo que enmascara las diferencias a nivel de segmento o de una sola célula.
