La aneuploidía es la principal causa genética de aborto espontáneo temprano en humanos. La mayoría de los errores en la segregación cromosómica ocurren durante la meiosis en los ovocitos. Por lo tanto, evaluar el punto de control de ensamblaje del huso en ovocitos es fundamental para comprender por qué los ovocitos son propensos a errores.
Aquí describimos tres técnicas para evaluar exhaustivamente la integridad de SAC en ovocitos de ratón mediante el examen de diferentes pasos críticos en el punto de control utilizando una combinación de imágenes en vivo e inmunofluorescencia. Cecilia Blengini, investigadora asociada de mi laboratorio. Para comenzar preparar un mililitro de medios de cultivo que contengan nocodazol y reversina con DMSO como control como se describe en el manuscrito.
Para la maduración de los ovocitos y las imágenes en vivo, use una placa precalentada de 96 pocillos en una incubadora. Y cargar el primer, segundo y tercer pocillo con 150 microlitros del control DMSO, nocodazol y nocodazol más tratamiento de reversina respectivamente. Mientras se mantiene la placa en la incubadora en las condiciones descritas en el manuscrito.
Para iniciar la maduración miótica, eliminar la milrinona transfiriendo secuencialmente los ovocitos a través de 6 gotas de 100 microlitros de medios de cultivo libres de milrinona que contienen DMSO. Y colóquelos en el pozo correspondiente de la placa de 96 pocillos. Usar una pipeta manual o bucal mientras se observan los ovocitos bajo un microscopio estéreo.
Imagen de los ovocitos utilizando un microscopio de campo brillante equipado con una cámara de incubadora con un ambiente controlado a 37 grados centígrados, 5% de dióxido de carbono y 80% de humedad. Capturar imágenes en el plano medio de los ovocitos a intervalos de 20 minutos durante 24 horas. Después de cuantificar el número de ovocitos que extruyen un cuerpo polar identificando las células que pasan por citoquinas asimétricas con una pequeña célula junto al óvulo y dentro de la zona pelúcida compartida.
Vea las imágenes utilizando un software de imágenes. Microinyectar pro-fase uno ovocitos detenidos con 100 nanogramos por microlitros de ARNc securina-gfp previamente preparados. Después de la microinyección, permita que los ovocitos se recuperen y traduzcan el ARN en la incubadora de dióxido de carbono durante al menos tres horas.
Luego cargue 150 microlitros de medios de cultivo con o sin cinco micromolares de nocodazol. Y 150 microlitros de medios de cultivo con 0,5 micromolares de reversina en tres pocillos diferentes de una placa de 96 pocillos. Lave los ovocitos microinyectados a través de seis gotas de medios de cultivo libres de milrinona y transfiera un tercio de los ovocitos a cada tratamiento.
Mantenga la placa en la incubadora a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono y 80% de humedad hasta que los ovocitos reanuden la meiosis, alrededor de tres horas después del lavado de milrinona. Grabar imágenes de la maduración de los ovocitos utilizando un microscopio de fluorescencia equipado con una cámara de incubadora. Utilice el software de análisis de imágenes para cuantificar la destrucción de securina-gfp y abra las imágenes del canal GFP, a partir del tiempo 0.1.
En el software de análisis preferido, utilice la herramienta de selección o forma para marcar cada ovocito y generar una región de interés para cada célula. Utilice la misma región de interés para seleccionar un área de fondo que se restará más tarde y mida la intensidad de píxeles GFP en cada región de interés en todos los puntos de tiempo. Por último, a cada valor GFP, reste la medición de la región de interés en el fondo.
Después de dividir la meiosis en tres grupos, transfiera cada grupo de meiosis a gotas de 100 microlitros de medios de cultivo libres de milrinona. Cubra las gotas con aceite mineral y colóquelas en la incubadora durante tres, cinco y siete horas para alcanzar la etapa temprana de prometafase uno, prometafase tardía uno y metafase uno, respectivamente. En los puntos de tiempo asignados, fije los ovocitos transfiriéndolos a gotas de 500 microlitros de paraformaldehído al 2% en tampón PME durante 20 minutos a temperatura ambiente utilizando un plato de vidrio de nueve pocillos.
Luego transfiera las células a un pozo limpio que contenga una gota de 500 microlitros de solución de bloqueo. Para continuar con la detección de MAD2, transfiera los ovocitos a un pocillo limpio que contenga una gota de 500 microlitros de solución de permeabilización. Después de incubar durante 20 minutos a temperatura ambiente, transfiera las células a un nuevo pocillo de solución de bloqueo e incube durante 10 minutos.
Transfiera los ovocitos a una gota de 30 microlitros de solución de bloqueo con anticuerpo anti-MAD2 y anticuerpo anti-centrómero e incube durante dos horas a temperatura ambiente. Para lavar el exceso de anticuerpos primarios después de transferir las células a 30 microlitros de tampón PME suplementado con 0,5% Tritón, incubar durante 10 minutos en la cámara humidificada. Transfiera las células a una gota de 30 microlitros de solución bloqueante que contenga anticuerpos secundarios como anti-humano 633 y anti-conejo 568.
E incubar durante una hora a temperatura ambiente. Para montar las celdas en el portaobjetos del microscopio, transfiera las células a una gota de 10 microlitros de medios de montaje que contengan DAPI. Agregue pequeños puntos de vaselina a cada esquina de la cubierta.
Colóquelos con cuidado encima de la caída del soporte de montaje y presione lentamente para distribuir. Selle el deslizamiento de la cubierta a la corredera con esmalte de uñas transparente. Imagen cinetocoros utilizando un microscopio confocal equipado con un objetivo 40 o 63X.
Y el uso de la señal de anticuerpos anticentrómeros determina el rango Z que permite obtener imágenes de toda el área cromosómica. Los ovocitos de control tratados con DMSO extruyeron un cuerpo polar alrededor de 14 horas después de la liberación de milrinona. Después de la activación de SAC, los ovocitos tratados con nocodazol se detuvieron en la metafase uno y no extruyeron un cuerpo polar.
Sin embargo, en ausencia de activación de SAC, los ovocitos extruyeron un cuerpo polar a pesar de no tener uniones de microtúbulos cinetocoros. Se evaluó la tasa de degradación de la securina-gfp durante la maduración miótica. En el que el control DMSO tratado ovocitos securina-gfp intensidad comienza a disminuir aproximadamente 10 horas después del lavado de milrinona.
Cuando los ovocitos maduraron en presencia del agente activador de SAC, nocodazol, los niveles de securina-gfp se mantuvieron estables durante todo el período de maduración miótica. Por el contrario, cuando se previene la activación de SAC con tratamiento de reversión, el patrón de securina-gfp se aceleró y la degradación comenzó aproximadamente cuatro horas después del lavado de milrinona consistente con la inhibición de SAC. Se emplearon imágenes confocales para detectar centrómeros y MAD2 de ovocitos madurados a prometafase uno temprana, prometafase uno tardía y metafase uno.
Para evaluar la intensidad de la señal SAC, se cuantificó la intensidad de píxeles MAD2 localizada en el cinetocoro. Los niveles significativos de reclutamiento de MAD2 para los cinetocoros ocurren en la prometafase uno temprana, cuando la mayoría de los cinetocoros no estaban unidos a los microtúbulos. Los niveles de MAD2 se redujeron en la prometafase posterior y estuvieron casi ausentes en la metafase uno, cuando todos los cinetocoros se unieron de manera estable a los microtúbulos.
Es importante destacar que cada una de estas técnicas tiene sus limitaciones y su interpretación. Y sugerimos realizar una combinación de estos métodos para evaluar la integridad del SAC. Estos tres ensayos permiten a los investigadores evaluar la rigurosidad del saco en los ovocitos, dando una idea sobre una posible causa de aneuploidía en óvulos humanos.
