La microscopía de fuerza atómica, o nanoindentación basada en voladizo AFM, se puede utilizar para determinar las propiedades mecánicas a nanoescala de materiales que varían el módulo, desde kilopascales hasta gigapascales tanto en aire como en fluidos. La nanoindentación basada en voladizo AFM permite obtener imágenes topográficas colocalizadas y mediciones cuantitativas de propiedades mecánicas in situ con precisión y resolución a nanoescala en una amplia gama de materiales y entornos relevantes. La nanoindentación basada en voladizo AFM se puede utilizar para diferenciar entre estructuras, tejidos o células sanas y enfermas que exhiben propiedades mecánicas divergentes.
Determinar con precisión el área de contacto de la muestra de la punta y la fuerza aplicada durante la nanoindentación basada en voladizo requiere una calibración cuidadosa de la sonda AFM, lo cual es desafiante pero esencial para las mediciones cuantitativas de propiedades mecánicas a nanoescala. Para comenzar, seleccione una microscopía de fuerza atómica o una sonda AFM apropiadas para la nanoindentación de la muestra prevista en función del medio, el módulo esperado, la topografía de la muestra y los tamaños de características relevantes. Cargue la sonda en el soporte de la sonda y fije el soporte de la sonda al cabezal de escaneo AFM.
Seleccione un modo de nanoindentación apropiado en el software AFM que permita al usuario controlar las rampas individuales. Alinee el láser en la parte posterior del voladizo de la sonda frente a la ubicación de la punta de la sonda y en el detector sensible a la posición, o PSD. Centra el punto del rayo láser en la parte posterior del voladizo maximizando la suma de voltaje.
A continuación, centre el punto del rayo láser reflejado en el PSD ajustando las señales de deflexión vertical y horizontal para que estén lo más cerca posible de cero, proporcionando así el rango de deflexión máximo detectable para producir un voltaje de salida proporcional a la deflexión en voladizo. Calibre la sensibilidad a la deflexión, o DS, del sistema AFM de la sonda. Para ello, configure y realice sangrías de calibración DS en Sapphire para lograr aproximadamente la misma deflexión de la sonda que las sangrías de muestra planificadas, ya que el desplazamiento medido es una función del ángulo de deflexión de la punta y se convierte en no lineal para deflexiones grandes.
Repita la rampa cinco veces. Determine el DS en nanómetros por voltio o la sensibilidad de la palanca óptica inversa y los voltios por nanómetro a partir de la pendiente de la porción lineal del régimen en contacto después del punto de contacto inicial en la curva de desplazamiento de fuerza resultante, o FD. Utilice el promedio de los valores para obtener la máxima precisión.
Si la desviación estándar relativa excede el 1%, vuelva a medir el DS, ya que a veces las primeras curvas FD no son ideales debido a la introducción inicial de fuerzas adhesivas. Si la constante de resorte K del voladizo de la sonda no está calibrada de fábrica, calibre la constante de resorte. Si la sonda no tiene una medición del radio de la punta calibrada de fábrica, mida el radio efectivo de la punta R.Si emplea el método de reconstrucción de la punta ciega, obtenga una imagen de la caracterización de la punta o la muestra de rugosidad utilizando una velocidad de escaneo lenta y altas ganancias de retroalimentación para ayudar a optimizar el seguimiento de las características muy nítidas.
Elija un tamaño de imagen y una densidad de píxeles en función del radio de punta esperado. A continuación, utilice el software de análisis de imágenes AFM para modelar la punta de la sonda y estimar su radio final y el diámetro efectivo de la punta a la profundidad de hendidura de la muestra esperada. Al completar la calibración de la sonda, introduzca los valores DS, K y R en el software.
Finalmente, ingrese una estimación de la relación de Poisson de la muestra para convertir el módulo reducido medido al módulo de muestra real. Si se emplea un modelo mecánico de contacto cónico o conosférico basado en la forma de la punta y la profundidad de hendidura, es necesario introducir el semiángulo de la punta. Navegue por la muestra debajo del encabezado AFM y participe en la región de interés deseada.
Controle la señal de deflexión vertical o realice una pequeña rampa inicial para verificar que la punta y la muestra estén en contacto. Ajuste la posición de la cabeza AFM ligeramente hacia arriba y vuelva a rampar. Repita hasta que la punta y la muestra estén fuera de contacto, como lo demuestra una rampa casi plana y una desviación vertical mínima del voladizo.
Una vez que no haya una interacción obvia de la muestra de la punta, baje el cabezal AFM en una cantidad correspondiente a aproximadamente el 50% del tamaño de la rampa para asegurarse de que la punta de la sonda no choque contra la muestra mientras mueve manualmente la cabeza AFM. Rampa de nuevo, repitiendo hasta que se observe una buena curva. Ajuste los parámetros de la rampa.
Seleccione un tamaño de rampa adecuado en función de la muestra y la profundidad de hendidura deseada. A continuación, seleccione una tasa de rampa adecuada. Un hertz es un buen punto de partida para la mayoría de las muestras.
Establezca el número de muestras por rampa para lograr la resolución deseada de la medición. Ajuste la X Rotate para reducir las fuerzas de cizallamiento en la muestra y la punta moviendo simultáneamente la sonda ligeramente en la dirección X mientras se sangra en la dirección Z. Utilice un valor para la X Rotate igual al ángulo de desplazamiento del soporte de la sonda en relación con la superficie normal.
A continuación, elija si desea emplear una rampa activada o no activada. Si se elige una rampa activada, establezca el umbral de activación para que produzca la hendidura deseada en la muestra. Realice una sangría en la ubicación elegida.
Seleccione y cargue los datos a analizar en el software. Valores calibrados de entrada para la constante de resorte, DS o sensibilidad de palanca óptica inversa, y radio de punta de sonda, junto con una estimación de la relación de Poisson de la muestra. Elija un modelo de mecánica de contacto de nanoindentación apropiado para la punta y la muestra.
Ejecute el algoritmo de ajuste. Compruebe el ajuste adecuado de las curvas FD. Un error residual bajo correspondiente a una unidad R-cuadrada promedio indica un buen ajuste al modelo elegido.
Si lo desea, compruebe las curvas individuales para inspeccionar visualmente la curva, el ajuste del modelo y los puntos de contacto calculados. Se muestran curvas FD casi ideales obtenidas en el aire en una muestra de pino loblolly incrustada en resina y en solución salina tamponada con fosfato en un núcleo de células madre mesenquimales. Con la sonda de silicio, la punta experimentó un desgaste significativo en relación con su estado prístino inicial a lo largo de la imagen.
Con cada imagen posterior, la punta se vuelve progresivamente más redondeada. En contraste con la sonda de diamante, el radio de la punta no cambió dentro de los límites del método de reconstrucción de la punta ciega, destacando la extrema resistencia al desgaste del diamante. Aquí se muestra una imagen de topografía AFM que cubre múltiples celdas con una representación pseudo 3D y un mapa de módulo correspondiente de una muestra de pino loblolly.
El mapa de módulo derivado de AFM generado al obtener una imagen AFM muestra que la inclusión mineral en el centro de las imágenes es significativamente más difícil que la matriz orgánica circundante. Se muestra el efecto del radio y la forma de la punta de la sonda en la apariencia de las características de alta relación de aspecto de una muestra de esquisto de Bakken. La nanoindentación basada en voladizo en células madre mesenquimales y núcleos aislados no mostró diferencias estadísticas en el módulo elástico.
Aquí se demuestra la morfología y las propiedades mecánicas de las bicapas lipídicas que contienen colesterol estudiadas por AFM. La calibración adecuada de la sonda y la selección de los parámetros de rampa apropiados en los modelos de mecánica de contacto son esenciales para las mediciones nanomecánicas precisas. Además de permitir mediciones modulares elásticas, la nanoindentación basada en voladizo AFM se puede utilizar para sondear la resistencia a la ruptura o la fuerza de ruptura de las bicapas de fosfolípidos en condiciones fisiológicas relevantes.
La nanoindentación basada en voladizos AFM ha permitido la investigación de los efectos de los knockouts estructurales, los tratamientos farmacéuticos y las vibraciones de baja intensidad para simular el ejercicio en las propiedades mecánicas de los núcleos de células madre mesenquimales.
