La microscopie à force atomique, ou nanoindentation à base de porte-à-faux AFM, peut être utilisée pour déterminer les propriétés mécaniques à l’échelle nanométrique de matériaux allant du module, des kilopascals aux gigapascals dans l’air et le fluide. La nanoindentation en porte-à-faux AFM permet une imagerie topographique co-localisée et des mesures quantitatives des propriétés mécaniques in situ avec une précision et une résolution à l’échelle nanométrique sur un large éventail de matériaux et d’environnements pertinents. La nanoindentation en porte-à-faux AFM peut être utilisée pour différencier les structures, les tissus ou les cellules sains et pathologiques qui présentent des propriétés mécaniques divergentes.
Déterminer avec précision la zone de contact de l’échantillon de pointe et la force appliquée lors de la nanoindentation en porte-à-faux nécessite un étalonnage minutieux de la sonde AFM, ce qui est difficile mais essentiel pour les mesures quantitatives des propriétés mécaniques à l’échelle nanométrique. Pour commencer, sélectionnez une microscopie à force atomique ou une sonde AFM appropriée pour la nanoindentation de l’échantillon prévu en fonction du milieu, du module attendu, de la topographie de l’échantillon et des tailles de caractéristiques pertinentes. Chargez la sonde sur le support de sonde et fixez le support de sonde à la tête de balayage AFM.
Sélectionnez un mode de nanoindentation approprié dans le logiciel AFM qui permet à l’utilisateur de contrôler les rampes individuelles. Alignez le laser à l’arrière du porte-à-faux de la sonde, en face de l’emplacement de la pointe de la sonde, et dans le détecteur sensible à la position, ou PSD. Centrez le spot de faisceau laser à l’arrière du porte-à-faux en maximisant la tension de somme.
Ensuite, centrez le point de faisceau laser réfléchi sur le PSD en ajustant les signaux de déviation verticale et horizontale pour qu’ils soient aussi proches de zéro que possible, fournissant ainsi la plage de déviation détectable maximale pour produire une tension de sortie proportionnelle à la déviation en porte-à-faux. Calibrer la sensibilité de déflexion, ou DS, du système AFM de la sonde. Pour ce faire, configurez et effectuez des retraits d’étalonnage DS sur Sapphire pour obtenir approximativement la même déviation de sonde que les retraits d’échantillon prévus, car le déplacement mesuré est fonction de l’angle de déviation de la pointe et devient non linéaire pour les grandes déflexions.
Répétez la rampe cinq fois. Déterminer le DS en nanomètres par volt ou la sensibilité inverse du levier optique et les volts par nanomètre à partir de la pente de la partie linéaire du régime en contact après le point de contact initial dans la courbe de déplacement de force résultante. Utilisez la moyenne des valeurs pour une précision maximale.
Si l’écart type relatif dépasse 1%, remesurez le DS, car parfois les premières courbes FD ne sont pas idéales en raison de l’introduction initiale des forces adhésives. Si la constante de ressort K du porte-à-faux de la sonde n’est pas étalonnée en usine, étalonnez la constante du ressort. Si la sonde n’a pas de mesure de rayon de pointe calibrée en usine, mesurez le rayon de pointe effectif R.Si vous utilisez la méthode de reconstruction de la pointe aveugle, imagez la caractérisation de la pointe ou l’échantillon de rugosité en utilisant une vitesse de balayage lente et des gains de rétroaction élevés pour aider à optimiser le suivi des caractéristiques très nettes.
Choisissez une taille d’image et une densité de pixels en fonction du rayon de pointe attendu. Ensuite, utilisez le logiciel d’analyse d’images AFM pour modéliser la pointe de la sonde et estimer son rayon d’extrémité et le diamètre effectif de la pointe à la profondeur d’indentation attendue de l’échantillon. Une fois l’étalonnage de la sonde terminé, entrez les valeurs DS, K et R dans le logiciel.
Enfin, entrez une estimation du rapport de Poisson de l’échantillon pour convertir le module réduit mesuré en module réel de l’échantillon. Si vous utilisez un modèle de mécanique de contact conique ou conosphérique basé sur la forme de la pointe et la profondeur d’indentation, il est nécessaire d’entrer le demi-angle de la pointe. Parcourez l’échantillon sous la tête AFM et engagez-vous sur la région d’intérêt souhaitée.
Surveillez le signal de déviation verticale ou effectuez une petite rampe initiale pour vérifier que la pointe et l’échantillon sont en contact. Ajustez légèrement la position de la tête AFM vers le haut et relancez. Répétez l’opération jusqu’à ce que la pointe et l’échantillon soient juste hors de contact, comme en témoignent une rampe presque plate et une déviation verticale minimale du porte-à-faux.
Lorsqu’aucune interaction évidente de l’échantillon de pointe n’est présente, abaissez la tête AFM d’une quantité correspondant à environ 50 % de la taille de la rampe pour vous assurer que la pointe de la sonde ne s’écrasera pas dans l’échantillon lors du déplacement manuel de la tête AFM. Ramper à nouveau, en répétant jusqu’à ce qu’une bonne courbe soit observée. Ajustez les paramètres de la rampe.
Sélectionnez une taille de rampe appropriée en fonction de l’échantillon et de la profondeur d’indentation souhaitée. Ensuite, sélectionnez un taux de rampe approprié. Un hertz est un bon point de départ pour la plupart des échantillons.
Réglez le nombre d’échantillons par rampe pour obtenir la résolution souhaitée de la mesure. Réglez la rotation X pour réduire les forces de cisaillement sur l’échantillon et la pointe en déplaçant simultanément la sonde légèrement dans la direction X tout en indentant dans la direction Z. Utilisez une valeur pour la rotation X égale à l’angle de décalage du porte-sonde par rapport à la normale de surface.
Ensuite, choisissez d’utiliser une rampe déclenchée ou non déclenchée. Si une rampe déclenchée est choisie, définissez le seuil de déclenchement pour obtenir l’indentation souhaitée dans l’échantillon. Effectuez un retrait à l’emplacement choisi.
Sélectionnez et chargez les données à analyser dans le logiciel. Valeurs étalonnées d’entrée pour la constante de ressort, DS ou sensibilité inverse du levier optique, et rayon de pointe de la sonde, ainsi qu’une estimation du rapport de Poisson de l’échantillon. Choisissez un modèle de mécanique de contact de nanoindentation approprié pour la pointe et l’échantillon.
Exécutez l’algorithme d’ajustement. Vérifiez le bon ajustement des courbes FD. Une faible erreur résiduelle correspondant à un R-carré moyen proche de l’unité indique un bon ajustement au modèle choisi.
Si vous le souhaitez, vérifiez les courbes individuelles pour inspecter visuellement la courbe, l’ajustement du modèle et les points de contact calculés. Des courbes FD presque idéales obtenues dans l’air sur un échantillon de pin loblolly incorporé dans de la résine et dans une solution saline tamponnée au phosphate sur un noyau de cellules souches mésenchymateuses sont représentées. Avec la sonde en silicium, la pointe a subi une usure importante par rapport à son état initial vierge tout au long de l’imagerie.
Avec chaque image suivante, la pointe devient progressivement plus arrondie. Contrairement à la sonde diamantée, le rayon de la pointe n’a pas changé dans les limites de la méthode de reconstruction de l’extrémité aveugle, ce qui souligne l’extrême résistance à l’usure du diamant. Une image topographique AFM couvrant plusieurs cellules avec une pseudo représentation 3D et une carte de module correspondante d’un échantillon de pin loblolly est montrée ici.
La carte de module dérivée de l’AFM générée lors de l’obtention d’une image AFM montre que l’inclusion minérale au centre des images est significativement plus difficile que la matrice organique environnante. L’effet du rayon et de la forme de la pointe de la sonde sur l’apparence des caractéristiques à rapport d’aspect élevé d’un échantillon de schiste de Bakken est montré. La nanoindentation basée sur le porte-à-faux sur les cellules souches mésenchymateuses et les noyaux isolés n’a montré aucune différence statistique dans le module élastique.
La morphologie et les propriétés mécaniques du cholestérol contenant des bicouches lipidiques étudiées par l’AFM sont démontrées ici. Un étalonnage approprié de la sonde et la sélection des paramètres de rampe appropriés dans les modèles de mécanique de contact sont essentiels pour des mesures nanomécaniques précises. En plus de permettre des mesures modulaires élastiques, la nanoindentation en porte-à-faux AFM peut être utilisée pour sonder la résistance à la rupture ou la force de rupture des bicouches phospholipidiques dans des conditions physiologiques pertinentes.
La nanoindentation en porte-à-faux AFM a permis d’étudier les effets des knockouts structurels, des traitements pharmaceutiques et des vibrations de faible intensité pour simuler l’exercice sur les propriétés mécaniques des noyaux de cellules souches mésenchymateuses.
