Damos las gracias a A. Tager y Shea B. por su colaboración en curso, y para proporcionar el tejido pulmonar utilizada para propósitos de demostración aquí. Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud de subvención HL-092961. Este trabajo fue realizado en parte en el Centro de Sistemas de Nanoescala (SNC), un miembro de la Red de Nanotecnología Nacional de Infraestructura, que es apoyada por la National Science Foundation NSF premio en ECS-0335765. SNC es parte de la Facultad de Artes y Ciencias de la Universidad de Harvard.

1. Tejido pulmonar Franja de preparación <ol><li> El tejido pulmonar es muy compatible y difícil de cortar en tiras para la caracterización de AFM. Para estabilizar transitoriamente la estructura pulmonar para el corte, inflar los pulmones del ratón aislados intratraqueal con el peso corporal de 50 ml / kg de baja 2% en gel de agarosa al punto (preparado en PBS) calentado a 37 ° C. Ate la tráquea y los pulmones inflados enfriar en un baño de PBS a 4 ° C durante 60 minutos. El gel de agarosa se ​​endurecen y en los espacios aéreos para estabilizar suavemente la estructura pulmonar durante este intervalo de 5. Mayores concentraciones de agarosa, un 3-4%, es decir, se puede utilizar para mejorar aún más la estabilización de tejidos para el corte. </li><li> Cortar el tejido de ratón de agarosa-estabilizado de pulmón con una navaja o una cuchilla de bisturí en tiras de 5 x 5 mm de longitud y anchura y 400 micras de espesor, luego se lava las tiras en un baño de PBS pre-calentado a 37 ° C con 100 ml de vidrio en un vaso de precipitados de sobremesa placa de agitación se calienta durante 5 minutos para eliminar los restos de agarosa. Para excluir a las grandes vías respiratorias y los vasos, cortar tiras de las regiones subpleurales distante de los bronquios principales madre. Si las vías respiratorias y los grandes vasos se van a imágenes, cortar tiras de tejido pulmonar más proximal de los bronquios principales madre. </li></ol> 2. AFM Microindentation y imágenes de fluorescencia <ol><li> Para aislar las áreas de interés para microindentation AFM, el tejido puede ser visualizado por microscopía de contraste de fase, o immunostained y se visualizan por microscopía de fluorescencia. Por inmunoticción, bloque de tiras de tejido con 5% de suero de la fuente del anticuerpo deseado secundaria (en PBS) durante 2 horas sin fijación o permeabilización a temperatura ambiente. </li><li> Incubar la tira de tejido con anticuerpos adecuados primaria (por ejemplo, de conejo anti-colágeno I para visualizar colágeno intersticial (1:250 dilución), de conejo anti-laminina (1:250 dilución) para visualizar la membrana basal) en un pocillo de una placa de 12 pocillos en un eje de balancín con agitación suave durante 1 hora, lavar la muestra tres veces durante 5 minutos cada uno con PBS, seguido de anticuerpo apropiado secundario conjugado con etiqueta fluorescente (por ejemplo, Alexa Fluor 546 cabra anti-conejo secundaria de anticuerpos (1:250 dilución)) para una hora a temperatura ambiente. </li><li> Lave las tiras de tejido fino extensivamente con PBS y se almacenan en PBS a 4 ° C </li><li> Inmediatamente antes de la caracterización de AFM, coloque la tira de tejido a un poli-l-lisina de 15 mm cubreobjetos levantando el cubreobjetos desde abajo el tejido flotante, lo que hace que la tira de tejido se extiende de manera uniforme sobre la superficie del cubreobjetos, si es necesario, la banda de sándwich con un paño limpio en segundo lugar, no recubierto cubreobjetos y aplicar una presión suave para ayudar con la adhesión del tejido a los portaobjetos con poli-L-lisina. </li><li> Calibrar el sistema AFM siguiendo las instrucciones del fabricante, inmediatamente antes de cada ronda de experimentos microindentation. Determinar dos parámetros fundamentales: 1) el resorte en voladizo constante utilizando el método de las fluctuaciones térmicas en el aire 6, y, 2) la sensibilidad de deflexión en voladizo, que es un parámetro utilizado para escalar la señal de salida de fotodiodo a la distancia de voladizo desviación real, Δd. Calibrar sensibilidad de deflexión mediante la obtención de un estándar de la curva fuerza-desplazamiento en PBS en un portaobjetos de vidrio limpio luego calcular la pendiente de la curva fuerza-desplazamiento (Fig.1b). En la medición de la curva fuerza-desplazamiento, la punta del AFM se extiende y se retrae hacia la superficie de la muestra en un solo lugar (sin barrido de direcciones en XY), con la deflexión del cantilever, Δd, controlará como una función de desplazamiento de su punta, Δz . </li></ol> Le recomendamos que utilice un nitruro de silicio en voladizo con un triángulo de 5 micras de diámetro borosilicato esférica punta (Novascan). El uso de sondas de AFM con un resorte de constante de 0,06 N / m, hemos caracterizado mecánicamente materiales blandos con módulos de corte que abarca de 100 a 50.000 Pa. <ol start="6"><li> Limpie la superficie inferior del cubreobjetos de la muestra con papel de seda, se sujetan a un portaobjetos de vidrio estándar con grasa de vacío, coloque la placa de vidrio sobre el escenario de la muestra AFM y cubrir el tejido con 500 l de PBS (temperatura ambiente). </li><li> Ajuste el microscopio para ver ocular para alinear la punta del AFM en el centro del campo de visión mediante el ajuste de la etapa de la muestra microscopio. Elija un área de interés en el papel moviendo el escenario de la muestra AFM, luego cambiar a la cámara CCD de visión para grabar la imagen de contraste de fase y / o imágenes de fluorescencia de los tejidos, según se desee. </li><li> Realizar la operación estándar de compromiso AFM moviendo la punta del AFM lentamente hacia abajo hasta que esté en contacto con la muestra. </li><li> Caracterización precisa microindentation AFM de muestras blandas requiere profundidades pequeña hendidura para evitar grandes tensiones locales que invalidan el modelo de Hertz utiliza para el cálculo elástico módulo. Para evitar grandes deformaciones, realizar el sangrado en el modo de disparo mediante el establecimiento de la flecha máxima en voladizo (puntos gatillo) a 500 nm. Este límite de deflexión frenará elfuerza de indentación máxima a menos de 30 nN (F = resorte en voladizo de desplazamiento * constante, o F max = 0,06 nN / nm * 500 nm = 30 nN). </li></ol> La velocidad del sangrado debe ser seleccionado para ser lo suficientemente lenta para explorar más elástica propiedades viscoelásticas de la muestra suave 7. Un rango de velocidad de 2.20 micras por segundo es adecuado para el tejido pulmonar. <ol start="10"><li> Por una sola medición de un área de interés, mover la sonda AFM a la ubicación de interés y realizar una sola muesca para recoger un nivel de desplazamiento de fuerza curva (la sonda sólo se mueve en la dirección Z, sin barrido XY). </li><li> Para el mapeo automático de una región de interés, cambiar al modo de la Fuerza-Map, seleccione el tamaño de escaneado y los puntos de muestreo en el área seleccionada. En el modo de Fuerza-Map, la punta del AFM tramas a través de la superficie de la muestra entre los movimientos de sangría, y recoge cada fuerza-desplazamiento curvas en cada punto dentro de una cuadrícula muestra definida. Más puntos de muestreo proporcionará una mayor resolución espacial, sino prolongar el tiempo necesario para el mapeo. Nos pareció que era práctico utilizar una cuadrícula de 16 x 16 muestra un mapa de 80 x 80 m área a una velocidad de sangrado de 20 micras por segundo, lo que se puede completar en unos 10 minutos. </li></ol> 3. Extracción de datos AFM <ol><li> Para calcular el módulo de Young, el ajuste de la curva fuerza-desplazamiento para el modelo de indentación Hertz esférica utilizando mínimos cuadrados no lineal adecuado curva 8 (Fig. 1 A, C): <img src="/files/ftp_upload/2911/2911eq1.jpg" alt="La ecuación 1" /> donde F = k c * Δ d, es la fuerza para doblar el voladizo, k c es el resorte en voladizo constante, R es el radio de la esfera punta, δ = Δ z - Δ d es el sangrado y υ es la relación de la muestra de Poisson (υ = 0,4 para el tejido pulmonar 9). </li><li> Para evaluar la calidad del ajuste, el cálculo del valor SSR, o la suma de los cuadrados de la diferencia entre los datos y los valores de ajuste, durante el ajuste de la curva no lineal. Eliminar las medidas poco fiables o sin interpretable por los datos de los descartes de los &quot;malos&quot; con los valores de las curvas de SSR de gran tamaño. </li><li> Si lo desea, convertir el módulo de elasticidad (E) de módulo de corte (G), utilizando la relación E = 2 x (1 + υ) x G. Para visualizar los patrones espaciales de la rigidez en el modo de recogida de la Fuerza-Map, la trama de datos en el contorno del módulo de mapas (por ejemplo, en 16 x 16 muestra la red que cubre un 80 x 80 m de área). </li><li> Para procesar una gran cantidad de datos de la curva fuerza, un algoritmo personalizado se puede escribir en forma automática de fuerza-desplazamiento curvas, módulos de extracción, y / o elastographs gráfico utilizando los mismos procedimientos y parámetros como se indica en 3.2 y 3.3 (por ejemplo, Matlab). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2911/2911fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1 (A) Esquema de microindentation AFM de una muestra suave sobre un sustrato rígido con una sonda esférica (Reproducido con permiso de Dimitriadis E., et al. Biophys 2002 J 8). (B) Representante de la curva fuerza-desplazamiento recogido de un portaobjetos de vidrio limpio en PBS para determinar la sensibilidad de deflexión en voladizo. (C) Representante de fuerza-desplazamiento curvas de recogida de suave (azul) y dura (rojo) muestras con los parámetros correspondientes a partir de (A). 4. Los resultados representativos: Figura 2A muestra una franja de parénquima pulmonar adjunta en poli-l-lisina cubreobjetos recubiertos de PBS con una sonda de AFM en el lugar justo encima de la región de interés y listo para el mapeo de microindentation. Figura 2B muestra que en el tejido bien cortado y teñido, la microarquitectura alveolar del parénquima pulmonar está bien conservado, como se observa mediante la tinción de inmunofluorescencia para laminina componente de la membrana basal sin fijación o permeabilización. Figura 2 CD tinción de inmunofluorescencia para mostrar colágeno I en fresco los pulmones de los ratones no fijadas cosechado previamente tratados con PBS (Fig. 2C), o tratados con bleomicina (Fig. 2D) para inducir fibrosis 10. La figura 3A muestra de la muestra de fuerza-desplazamiento obtenidas de parcelas microindentation AFM. Con la misma fuerza aplicada, AFM punta genera una gran escotadura en una región blanda (línea azul), resultando en un relativamente &quot;plano&quot; de desplazamiento de fuerza frente a la curva de una pequeña hendidura y un &quot;fuerte&quot; curva de fuerza-desplazamiento para una región más rígido ( línea roja). Con el fin de obtener las curvas de limpiar la fuerza, después de cada muesca de la punta del AFM debe ser retirado por completo de la superficie de la muestra y libre de contacto antes de la sangría que viene. Este estado libre de contacto corresponde a la región plana de la curva en la Figura 3, donde la punta se traduce sin desviarse en voladizo. Figura 3B muestra una curva típica falsa sin una región plana que se produce cuando la punta no está completamente cerrada a partir de la superficie de la muestra (por ejemplo, muestra una suavettaches a la punta) por lo que es imposible determinar el punto de contacto. Si la punta está completamente atrapado en la muestra suave, la curva puede verse como se muestra en la Figura 3C, sin desviación clara, pero el ruido pequeño. La Figura 4 muestra los datos de corte módulo extraído de las curvas de fuerza-desplazamiento se muestra espacialmente como mapas de la rigidez (elastographs), donde las escalas de color con el módulo de corte. Elastographs demuestran grandes diferencias en el alcance y la distribución de los módulos de corte de tejidos en condiciones normales (Fig. 4A) y fibrosis (Fig. 4B) parénquima pulmonar, y grandes variaciones espaciales en el módulo de corte, sobre todo dentro de la muestra fibrosis pulmonar. <img src="/files/ftp_upload/2911/2911fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. (A) Micrografía de contraste de fase que muestra una sonda de AFM en una franja de pulmón de ratón parénquima. Barra de escala, de 50 micras. (B) La inmunotinción de laminina en el tejido pulmonar normal de ratón que muestra la microarquitectura alveolar del parénquima pulmonar normal. Cuadro blanco indica típica 80 por 80μm área de la cartografía elasticidad. Barra de escala: 20 micras. (C y D) La inmunotinción de colágeno I en solución salina (C) y bleomicina (D) trata de ratón parénquima pulmonar. Las barras de escala, 100 micras. <img src="/files/ftp_upload/2911/2911fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. (A) Representante interpretar las curvas de fuerza-desplazamiento recogidos de solución salina (azul) y bleomicina tratada (rojo) del ratón parénquima pulmonar, respectivamente. Las líneas de negro son la mejor opción que resulta del modelo de Hertz esférica y están etiquetados con sus correspondientes módulos de Young calculado. (B, C) representante de la ONU-interpretables de fuerza-desplazamiento curvas. <img src="/files/ftp_upload/2911/2911fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Elastographs Representante recogida de solución salina (A) y bleomicina tratados (B) ratón parénquima pulmonar. Las barras de colores indican módulo de corte en kilopascales. Etiquetas de los ejes indican la escala espacial en micrómetros. Barra de escala: 20 m

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No hay conflictos de interés declarado.

Caracterización mecánica del tejido pulmonar con microindentation AFM ofrece una resolución espacial sin precedentes (Fig. 4), proporcionando una perspectiva única sobre las variaciones descrito en la rigidez del tejido. Como ejemplo de su utilidad, previa escala macro mediciones en bandas de tejido normal y fibrosis pulmonar indica un aproximado de 2 a 3 veces aumento de la elastancia con fibrosis 11,12. Por el contrario, revela que microindentation AFM endurecimiento del tejido es muy localizada, con algunas regiones presentan aumentos de hasta ~ 30 veces en módulo de corte por encima de la mediana observada en el tejido pulmonar normal 10. Como matriz de rigidez ahora se sabe que influyen en la crítica función de las células, estas mediciones locales ofrecen parámetros muy valiosa para mejorar la biofidelity de estudio de cultivos celulares de células de los pulmones. Varias cuestiones de índole práctica con el uso de tiras delgadas de tejido pulmonar. Las superficies de las tiras no sea totalmente plana, como el perfil del tejido sigue la arquitectura subyacente de los alvéolos. El sistema AFM se ajusta automáticamente la posición de punta en la dirección Z durante el sangrado cuando la superficie de la muestra variación de la altura es menor que 15 micras para ayudar a superar este desafío. Las mediciones se realizan a temperatura ambiente, no 37 ° C, por lo que las desviaciones en las propiedades mecánicas causadas por esta variación en la temperatura no puede ser evaluada, aunque se espera que sea menor. La influencia de la arquitectura de la pared alveolar subyacente en observar las propiedades mecánicas es difícil de determinar con la configuración del microscopio de luz actual. Por ejemplo, sería conveniente determinar si las paredes alveolares presentan anisotropía y propiedades mecánicas diferentes al sangrado en direcciones alineadas con o transversal al plano de la pared. Sin embargo, los ejemplares actuales son gruesas y el sistema de imagen no tiene capacidades 3D, por lo que no es posible determinar la orientación local de la pared alveolar en cada punto de contacto. Por último, la influencia de los componentes celulares de medir las propiedades mecánicas aún no ha sido dilucidado. En los métodos detallados aquí, no se hacen esfuerzos para eliminar específicamente los componentes celulares de los tejidos. Sin embargo, las células presentes en la superficie disponible para el sangrado es poco probable que sea viable, dado el tiempo transcurrido desde la cosecha de tejidos y la necesidad de cortar el tejido para obtener acceso a los alvéolos. Experimentos específicos para eliminar las células, o repoblar matrices con células viables, y evaluar los cambios resultantes en la rigidez del tejido que parece estar justificada. Dado que el tejido no fijado fresco que se necesita para estas mediciones, el tiempo transcurrido desde la recolección de tejido para la medición debe ser mínimo y las muestras deben ser almacenadas a 4 ° C para evitar cambios en las propiedades mecánicas. Se debe prestar especial atención cada vez que tiras de tejido se transfieren entre los contenedores durante el lavado o la tinción de modo que un mínimo de distorsión o daño se genera. Para la aplicación de AFM en líquido, es un paso crucial para cortar el tejido lo más plano posible e inmovilizar la muestra en el portaobjetos de apoyo. Si está disponible, una máquina automática de seccionamiento como una máquina de cortar el tejido vibratome o puede ser utilizado para cortar rebanadas de espesor muy uniforme. Es importante colocar las tiras de tejido inmediatamente antes de las mediciones de AFM y minimizar el tiempo transcurrido para las mediciones de AFM en la muestra final se separará de los cubreobjetos. Una observación útil es que las grandes bandas parecen conectar de manera más estable para cubrir los resbalones y permanecer en su lugar durante un período prolongado en que las pequeñas tiras de PBS. Microindentation AFM puede caracterizar muestras que abarcan una amplia gama de 100 Pa a 50 kPa (módulo de corte) cuando se utiliza un estándar de 0,06 N / m en voladizo con un diámetro de la punta esférica 5 micras. Este rango puede ser ampliado mediante sondas con diferentes constantes de los resortes, las sondas de AFM con las puntas de vidrio esférico de 0,6 a 12 um de diámetro y constantes de la primavera que van desde 0,01 hasta 0,58 N / m están disponibles comercialmente (por ejemplo, Novascan) y de uso general 3. Con una punta de 5 micras esférico, el área de contacto entre la punta teórica y el tejido es de unos 9.5 m 2 para el sangrado 400-700 nm (Fig. 1A). Consejos más o menos grandes se pueden utilizar para proporcionar las escalas más pequeñas o más grandes de la resolución espacial. Puntas piramidales también se han utilizado en microindentation AFM 13-16, proporcionando pequeñas áreas de contacto y así aumentar la resolución espacial en la cartografía, a pesar de conexión de datos es más complejo de esta geometría de la punta. Varias limitaciones a este método se debe tener en cuenta. El pulmón ha sido tradicionalmente caracterizada mecánica no invasiva, por ejemplo el uso de presión-volumen de análisis de 17 o punch-sangría de todo el pulmón 19,20. Métodos invasivos, tales como el descrito aquí alterar la arquitectura del pulmón de manera importante a través de la pérdida de la int aire-líquidoerface que existe normalmente en los pulmones llenos de aire y la pérdida de pre-tensión que mantiene la inflación pulmonar parcial a la relajación de los músculos respiratorios. Estas limitaciones son comunes a todas las mediciones realizadas en las tiras de tejido pulmonar de 18 años. Cabe destacar, sin embargo, la rigidez media medida en el parénquima del tejido pulmonar normal (módulo de corte ~ 0.5kPa) no difieren sustancialmente de las estimaciones basadas en perforación, sangrado de los pulmones intactos en los volúmenes de descanso 19,20. Mientras que el tejido pulmonar se sabe que presentan no lineal de refuerzo con deformación creciente, no es posible probar de forma rigurosa si esta propiedad persiste hasta la escala micro, con los métodos empleados aquí. El modelo de Hertz supone homogeneidad de la muestra. Sin embargo, la mayoría de los materiales biológicos, como el parénquima pulmonar, son cada vez más heterogéneo a la disminución de escalas espaciales. La heterogeneidad de la muestra puede resultar en manchas, como la variación de módulo de Young en función de profundidad de penetración, es decir, en función de la capa o componente que está deformando. La heterogeneidad en el plano xy puede ser limitado por elegir cuidadosamente el tamaño adecuado punta esférica en función de la microestructura del material biológico propuesto por Dimitriadis EK et al. 8 Es mucho más difícil de predecir o corregir el error del modelo Hertz debido al material heterogeneidad en la dirección z. Azeloglu et al. ha propuesto recientemente un modelo híbrido computacional para caracterizar las propiedades elásticas del sustrato heterogéneo con inclusiones discretos integrados 21. Su nueva técnica proporciona un medio potencial para calcular las propiedades de la inclusión de materiales heterogéneos, la superación de las limitaciones del análisis hertzianas. El modelo de Hertz también asume un comportamiento elástico absoluta, mientras que los materiales biológicos suelen mostrar en función del tiempo las conductas viscoelástico. Una caracterización viscoelástica lleno de tejido se puede obtener mediante la variación de las velocidades de sangrado utilizado. Es importante destacar que, previa escala macro pruebas mecánicas del tejido pulmonar normal y fibrosis demuestra débil dependencia de la frecuencia de las propiedades mecánicas del tejido pulmonar, y la preservación de las diferencias entre las propiedades de los tejidos normales y fibrótico mecánicas en todas las frecuencias a prueba 11. Estos hallazgos sugieren que la medición de las propiedades mecánicas con una velocidad de sangrado individual con AFM capta un aspecto esencial de los cambios en las propiedades mecánicas del tejido que acompañan a la fibrosis. La relación de Poisson de 0,4 para el tejido pulmonar utilizado en este trabajo es a partir de una medición macroscópica 9. Por desgracia, la relación de Poisson a micro-escala y los cambios en estado de enfermedad no están disponibles en la literatura. Como alternativas a la E, E / (1-υ 2) o (1-υ 2) / πE (k denota la constante elástica) 22 se puede calcular a partir de microindentation AFM e informó de que la relación de Poisson es desconocida. Para la mayoría de los biomateriales de Poisson está en el rango de 0,4 a 0,5, debido a su alto contenido de agua. Dentro del rango de 0.3-0.5, el factor 1 / (1-υ 2) sólo varía desde 1,10 hasta 1,33, de manera que las variaciones razonables en la relación de Poisson ejercen sólo un efecto modesto en el módulo informó. El incremento en el módulo de corte que nos informe por tejido fibrótico en relación con el tejido normal es varias veces en magnitud, lo que implica que los errores asociados con las variaciones en el coeficiente de Poisson son menores en relación con los cambios en las propiedades mecánicas observadas. El algoritmo actual y el código que puede ser utilizado para el análisis de los datos de fuerza-desplazamiento está sujeto a la condición de aplicación específica y las características posteriores de las diversas poblaciones de las curvas de fuerza-desplazamiento. Si un análisis más sofisticado de interés, se puede consultar el trabajo de Lin et al. 23. Los autores recopilaron una serie de estrategias sinérgicas en un algoritmo que supera muchas de las complicaciones que previamente han obstaculizado los esfuerzos para automatizar la instalación de los modelos de Hertz de los datos de sangrado. Otras áreas están disponibles para un mayor desarrollo y explotación de este método. En los casos en que uno está interesado en la visualización de las paredes alveolares, sin etiquetado de anticuerpos, tanto la elastina y el colágeno se puede visualizar desde su señal autofluorescentes en el espectro de color verde. Por otro lado, una mejor imagen, ya sea utilizando delgadas secciones de tejidos, técnicas de imágenes en 3D, o ambos, podrían mejorar la capacidad de relacionar la arquitectura del tejido subyacente con las propiedades mecánicas. Mientras que los métodos actuales permiten a las manchas y la visualización de los componentes de la matriz extracelular, como colágeno y laminina, los esfuerzos adicionales podrían ser destinados a la tinción de marcadores de superficie celular para identificar poblaciones específicas de células y caracterizar los microambientes mecánica en las cercanías de dichas poblaciones. Alternatively, el tejido podría obtenerse de ratones que expresan fluorescencia etiquetados linaje de marcadores de células o proteínas específicas para perseguir el mismo objetivo. Finalmente, el método detallado aquí parece adecuada para caracterizar otras características anatómicas en los pulmones, como los vasos que remodelar en la hipertensión, y las vías respiratorias que remodelar en el asma. Sobre la base de su actual estado de desarrollo y el potencial de seguir mejorando, microindentation AFM parece dispuesta a ceder información valiosa sobre los cambios en la rigidez de los tejidos que acompañan a la progresión de la enfermedad en el pulmón, y sin duda será de valor en la caracterización de los cambios espaciales y temporales en el la rigidez de una variedad de otros tejidos blandos.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios </th></tr><tr><td> AFM punta </td><td> Novascan </td><td> PT.GS </td><td> 5 micras de borosilicato de cuentas, 0,06 N / m </td></tr><tr><td> Poli-L-lisina cubreobjetos </td><td> VWR </td><td> 354085 </td><td> BD BioCoat 12 mm redondo de vidrio No.1 </td></tr><tr><td> Agarosa, temperatura de gelificación de baja </td><td> Sigma </td><td> A0701 </td><td></td></tr><tr><td> Conejo anti-colágeno I (Rb PAB) de anticuerpos </td><td> Abcam </td><td> ab34710-100 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 546 cabra anti-conejo de anticuerpos </td><td> Invitrogen </td><td> A11010 </td><td></td></tr><tr><td> Conejo anti-laminina </td><td> Sigma </td><td> L9393 </td><td></td></tr></tbody></table>

micro-mechanical characterization of lung tissue using atomic force microscopy

Matriz de rigidez influye fuertemente en el crecimiento, diferenciación y función de las células adherentes 1-3. En la escala macro de la rigidez de los tejidos y órganos dentro del cuerpo humano abarcan varios órdenes de magnitud 4. Se sabe mucho menos acerca de cómo la rigidez varía espacialmente dentro de los tejidos, y lo que el alcance y la escala espacial de los cambios de rigidez en los procesos de enfermedades que resultan en la remodelación tisular. Para entender mejor cómo los cambios en la matriz de rigidez contribuir a la fisiología celular en la salud y la enfermedad, las mediciones de la rigidez del tejido obtenido en una escala espacial relevante para las células residentes son necesarios. Esto es particularmente cierto para el pulmón, un tejido altamente compatible y elástico en el que la remodelación de la matriz es una característica importante en enfermedades como el asma, el enfisema, la hipertensión y la fibrosis. Para caracterizar el medio ambiente local mecánica del parénquima pulmonar en una escala espacial relevante para las células residentes, que han desarrollado métodos para medir directamente las propiedades locales elástica de tejido fresco de pulmón murino mediante microscopía de fuerza atómica (AFM) microindentation. Con la elección apropiada de AFM penetrador, en voladizo, y profundidad de penetración, estos métodos permiten realizar mediciones de locales módulo de tejido de corte en paralelo con contraste de fase y de imágenes de fluorescencia de la región de interés. El muestreo sistemático de las tiras de tejido proporciona mapas de las propiedades mecánicas del tejido que revelan las variaciones locales de espacio en el módulo de corte. Las correlaciones entre las propiedades mecánicas y características subyacentes anatomopatológicas ilustrar cómo la rigidez varía con la deposición de la matriz en la fibrosis. Estos métodos pueden extenderse a otros tejidos blandos y los procesos de la enfermedad para revelar cómo las propiedades mecánicas del tejido local varían a través del espacio y la progresión de la enfermedad.

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Micro-Mechanical Characterization of Lung Tissue Using Atomic Force Microscopy

La rigidez de la matriz extracelular influye fuertemente en múltiples conductas de las células adherentes. Matriz de rigidez varía espacialmente a lo largo de un tejido, y sufre modificaciones en las condiciones de diversas enfermedades. Aquí desarrollamos métodos para caracterizar las variaciones espaciales en la rigidez de los tejidos del ratón normal de los pulmones y fibrosis con microindentation microscopia de fuerza atómica.

Micro-Mecánica Caracterización del tejido pulmonar con microscopía de fuerza atómica

Matrix stiffness strongly influences growth, differentiation and function of adherent cells1-3.  On the macro scale the stiffness of tissues and organs ...

micro-mechanical-characterization-lung-tissue-using-atomic-force

Research

JoVE Journal

Biology

22.7K vistas.  Harvard School of Public Health. La rigidez de la matriz extracelular influye fuertemente en múltiples conductas de las células adherentes. Matriz de rigidez varía espacialmente a lo largo de un tejido, y sufre modificaciones en las condiciones de diversas enfermedades. Aquí desarrollamos métodos para caracterizar las variaciones espaciales en la rigidez de los tejidos del ratón normal de los pulmones y fibrosis con microindentation microscopia de fuerza atómica.

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Live Cell Response to Mechanical Stimulation Studied by Integrated Optical and Atomic Force Microscopy

To understand the mechanism by which living cells sense mechanical forces, and how they respond and adapt to their environment, a new technology able to investigate cells behavior at sub-cellular level with high spatial and temporal resolution was developed. Thus, an atomic force microscope (AFM) was integrated with total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy and fast-spinning disk (FSD) confocal microscopy. The integrated system is broadly applicable across a wide range of molecular dynamic studies in any adherent live cells, allowing direct optical imaging of cell responses to mechanical stimulation in real-time. Significant rearrangement of the actin filaments and focal adhesions was shown due to local mechanical stimulation at the apical cell surface that induced changes into the cellular structure throughout the cell body. These innovative techniques will provide new information for understanding live cell restructuring and dynamics in response to mechanical force. A detailed protocol and a representative data set that show live cell response to mechanical stimulation are presented.

This paper aims to instruct the reader in the operation of an integrated atomic force-optical imaging microscope for mechanical stimulation of live cells in culture. A step-by-step protocol is presented. A representative data set that shows live cell response to mechanical stimulation is presented.

Respuesta de células vivas a la estimulación mecánica estudiados por microscopía óptica integrada la Fuerza Atómica y

To understand the mechanism by which living cells sense mechanical forces, and how they respond and adapt to their environment, a new technology able to ...

Investigación

Biología

Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes. More than 700 human miRNAs have been identified so far with each having up to hundreds of unique target mRNAs. Computational tools, expression and proteomics assays, and chromatin-immunoprecipitation-based techniques provide important clues for identifying mRNAs that are direct targets of a particular miRNA. In addition, 3'UTR-reporter assays have become an important component of thorough miRNA target studies because they provide functional evidence for and quantitate the effects of specific miRNA-3'UTR interactions in a cell-based system. To enable more researchers to leverage 3'UTR-reporter assays and to support the scale-up of such assays to high-throughput levels, we have created a genome-wide collection of human 3'UTR luciferase reporters in the highly-optimized LightSwitch Luciferase Assay System. The system also includes synthetic miRNA target reporter constructs for use as positive controls, various endogenous 3'UTR reporter constructs, and a series of standardized experimental protocols.
Here we describe a method for co-transfection of individual 3'UTR-reporter constructs along with a miRNA mimic that is efficient, reproducible, and amenable to high-throughput analysis.

Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3&#039;UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and have been shown to play a role in numerous biological processes. To better understand miRNA-UTR interactions, we have created a genome-wide collection of 3 UTR luciferase reporters paired with a novel luciferase gene and assay reagent, the LightSwitch system.

Objetivos la identificación de los microARN humanos con el sistema de ensayo con luciferasa LightSwitch reportero 3&#39;UTR-Construye y microRNA un imitador de las células adherentes

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes.  More than 700 human miRNAs have been ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule imaging assays which allows adhesion of single virions to glass surfaces with specificity. This preparation is based on grafting the surface of the glass with a mixture of PLL-g-PEG and PLL-g-PEG-Biotin, adding a layer of avidin, and finally creating virion anchors through attachment of biotinylated virus specific antibodies. We have applied this technique across a range of experiments including atomic force microscopy (AFM) and super-resolution fluorescence imaging. This sample preparation method results in a control adhesion of the virions to the surface.

The attachment of virions to a surface is a requirement for single virion imaging by Super-resolution fluorescence imaging or atomic force microscopy (AFM). Here we demonstrate a sample preparation method for controlled adhesion of virions to glass surfaces suitable for use in AFM and super-resolution fluorescence imaging.

Preparación de muestras para microscopía de fuerza atómica de virión único e imágenes de fluorescencia de súper resolución

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

An Immunofluorescent Method for Characterization of Barrett&#8217;s Esophagus Cells

Esophageal adenocarcinoma (EAC) has an overall survival rate of less than 17% and incidence of EAC has risen dramatically over the past two decades. One of the primary risk factors of EAC is Barrett&#8217;s esophagus (BE), a metaplastic change of the normal squamous esophagus in response to chronic heartburn. Despite the well-established connection between EAC and BE, interrogation of the molecular events, particularly altered signaling pathways involving progression of BE to EAC, are poorly understood. Much of this is due to the lack of suitable in vitro models available to study these diseases. Recently, immortalized BE cell lines have become commercially available allowing for in vitro studies of BE. Here, we present a method for immunofluorescent staining of immortalized BE cell lines, allowing in vitro characterization of cell signaling and structure after exposure to therapeutic compounds. Application of these techniques will help develop insight into the mechanisms involved in BE to EAC progression and provide potential avenues for treatment and prevention of EAC.

An Immunofluorescent Method for Characterization of Barrett&amp;#8217;s Esophagus Cells

There is a discernible need for improved information on molecular drivers of Barrett&#8217;s Esophagus. Immunofluorescent staining is a useful technique for understanding the effects of cell signaling on cell morphology. We present a simple, effective protocol for the use of immunofluorescent staining to assess therapeutic treatment in Barrett&#8217;s Esophagus cells.

Un método de inmunofluorescencia para la caracterización de las células del esófago de Barrett

Esophageal adenocarcinoma (EAC) has an overall survival rate of less than 17% and incidence of EAC has risen dramatically over the past two decades. One ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a versatile analytical tool for characterizing viscoelastic mechanical properties for a variety of materials ranging from hard (plastic, glass, metal, etc.) surfaces to cells on any substrate. It has been widely used to measure the stiffness of cells, but less frequently used to measure the stiffness of aortas. In this paper, we will describe the procedures for using AFM in contact mode to measure the ex vivo elastic modulus of unloaded mouse arteries. We describe our procedure for isolation of mouse aortas, and then provide detailed information for the AFM analysis. This includes step-by-step instructions for alignment of the laser beam, calibration of the spring constant and deflection sensitivity of the AFM probe, and acquisition of force curves. We also provide a detailed protocol for data analysis of the force curves.

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

We present detailed protocols for isolation of aortas from mouse and measurement of their elastic modulus using atomic force microscopy.

La medición de la rigidez de<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Ratón aortas Usando microscopía de fuerza atómica

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Characterizing Mechanical Properties of Primary Cell Wall in Living Plant Organs Using Atomic Force Microscopy

The mechanical properties of the primary cell walls determine the direction and rate of plant cell growth and, therefore, the future size and shape of the plant. Many sophisticated techniques have been developed to measure these properties; however, atomic force microscopy (AFM) remains the most convenient for studying cell wall elasticity at the cellular level. One of the most important limitations of this technique has been that only superficial or isolated living cells can be studied. Here, the use of atomic force microscopy to investigate the mechanical properties of primary cell walls belonging to the internal tissues of a plant body is presented. This protocol describes measurements of the apparent Young&#39;s modulus of cell walls in roots, but the method can also be applied to other plant organs. The measurements are performed on vibratome-derived sections of plant material in a liquid cell, which allows (i) avoiding the use of plasmolyzing solutions or sample impregnation with wax or resin, (ii) making the experiments fast, and (iii) preventing dehydration of the sample. Both anticlinal and periclinal cell walls can be studied, depending on how the specimen was sectioned. Differences in the mechanical properties of different tissues can be investigated in a single section. The protocol describes the principles of study planning, issues with specimen preparation and measurements, as well as the method of selecting force-deformation curves to avoid the influence of topography on the obtained values of elastic modulus. The method is not limited by sample size but is sensitive to cell size (i.e., cells with a large lumen are difficult to examine).

Studies of cell wall biomechanics are essential for understanding plant growth and morphogenesis. The following protocol is proposed to investigate thin primary cell walls in the internal tissues of young plant organs using atomic force microscopy.

Caracterización de las propiedades mecánicas de la pared celular primaria en órganos vegetales vivos mediante microscopía de fuerza atómica

The mechanical properties of the primary cell walls determine the direction and rate of plant cell growth and, therefore, the future size and shape of the ...

Measurement of Liver Stiffness Using Atomic Force Microscopy Coupled with Polarization Microscopy

Matrix stiffening has been recognized as one of the key drivers of the progression of liver fibrosis. It has profound effects on various aspects of cell behavior such as cell function, differentiation, and motility. However, as these processes are not homogeneous throughout the whole organ, it has become increasingly important to understand changes in the mechanical properties of tissues on the cellular level.
To be able to monitor the stiffening of collagen-rich areas within the liver lobes, this paper presents a protocol for measuring liver tissue elastic moduli with high spatial precision by atomic force microscopy (AFM). AFM is a sensitive method with the potential to characterize local mechanical properties, calculated as Young&#39;s (also referred to as elastic) modulus. AFM coupled with polarization microscopy can be used to specifically locate the areas of fibrosis development based on the birefringence of collagen fibers in tissues. Using the presented protocol, we characterized the stiffness of collagen-rich areas from fibrotic mouse livers and corresponding areas in the livers of control mice.
A prominent increase in the stiffness of collagen-positive areas was observed with fibrosis development. The presented protocol allows for a highly reproducible method of AFM measurement, due to the use of mildly fixed liver tissue, that can be used to further the understanding of disease-initiated changes in local tissue mechanical properties and their effect on the fate of neighboring cells.

We present a protocol to measure the elastic moduli of collagen-rich areas in normal and diseased liver using atomic force microscopy. The simultaneous use of polarization microscopy provides high spatial precision for localizing collagen-rich areas in the liver sections.

Medición de la rigidez hepática mediante microscopía de fuerza atómica junto con microscopía de polarización

Matrix stiffening has been recognized as one of the key drivers of the progression of liver fibrosis. It has profound effects on various aspects of cell ...

Contact Mode Atomic Force Microscopy as a Rapid Technique for Morphological Observation and Bacterial Cell Damage Analysis

Electron microscopy is one of the tools required to characterize cellular structures. However, the procedure is complicated and expensive due to the sample preparation for observation. Atomic force microscopy (AFM) is a very useful characterization technique due to its high resolution in three dimensions and because of the absence of any requirement for vacuum and sample conductivity. AFM can image a wide variety of samples with different topographies and different types of materials. 
AFM provides high-resolution 3D topography information from the angstrom level to the micron scale. Unlike traditional microscopy, AFM uses a probe to generate an image of the surface topography of a sample. In this protocol, the use of this type of microscopy is suggested for the morphological and cell damage characterization of bacteria fixed on a support. Strains of Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Escherichia coli (ATCC 25922), and Pseudomonas hunanensis (isolated from garlic bulb samples) were used. In this work, bacterial cells were grown in specific culture media. To observe cell damage, Staphylococcus aureus and Escherichia coli were incubated with different concentrations of nanoparticles (NPs). 
A drop of bacterial suspension was fixed on a glass support, and images were taken with AFM at different scales. The images obtained showed the morphological characteristics of the bacteria. Further, employing AFM, it was possible to observe the damage to the cellular structure caused by the effect of NPs. Based on the images obtained, contact AFM can be used to characterize the morphology of bacterial cells fixed on a support. AFM is also a suitable tool for the investigation of the effects of NPs on bacteria. Compared to electron microscopy, AFM is an inexpensive and easy-to-use technique.

Here, we present the application of atomic force microscopy (AFM) as a simple and fast method for bacterial characterization and analyze details such as the bacterial size and shape, bacterial culture biofilms, and the activity of nanoparticles as bactericides.

Microscopía de fuerza atómica en modo de contacto como técnica rápida para la observación morfológica y el análisis del daño celular bacteriano

Electron microscopy is one of the tools required to characterize cellular structures. However, the procedure is complicated and expensive due to the ...

Medición de la rigidez en los capilares de la retina y la matriz subendotelial de ratón

Isolation of Mouse Retinal Capillaries and Subendothelial Matrix for Stiffness Measurement Using Atomic Force Microscopy

Retinal capillary degeneration is a clinical hallmark of the early stages of diabetic retinopathy (DR). Our recent studies have revealed that diabetes-induced retinal capillary stiffening plays a crucial and previously unrecognized causal role in inflammation-mediated degeneration of retinal capillaries. The increase in retinal capillary stiffness results from the overexpression of lysyl oxidase, an enzyme that crosslinks and stiffens the subendothelial matrix. Since tackling DR at the early stage is expected to prevent or slow down DR progression and associated vision loss, subendothelial matrix, and capillary stiffness represent relevant and novel therapeutic targets for early DR management. Further, direct measurement of retinal capillary stiffness can serve as a crucial preclinical validation step for the development of new imaging techniques for non-invasive assessment of retinal capillary stiffness in animal and human subjects. With this view in mind, we here provide a detailed protocol for the isolation and stiffness measurement of mouse retinal capillaries and subendothelial matrix using atomic force microscopy.

Autor destacado: Investigación de la rigidez vascular y la inflamación en la retinopatía diabética temprana

We recently identified retinal capillary stiffening as a new paradigm for retinal dysfunction associated with diabetes. This protocol elaborates the steps for isolation of mouse retinal capillaries and the subendothelial matrix from retinal endothelial cultures, followed by a description of the stiffness measurement technique using atomic force microscopy.