Este protocolo proporciona una referencia confiable para preparar una suspensión unicelular de alta calidad del intestino de tilapia del Nilo para facilitar estudios a nivel unicelular en especies de peces acuícolas. La tecnología es altamente eficiente y se puede implementar en la mayoría de las condiciones de laboratorio. Reduce la necesidad de ensayos adicionales para preparar suspensiones unicelulares para especies de peces de acuicultura.
Comience enjuagando el pez tilapia del Nilo de seis meses de edad en agua estéril bien aireada durante 15 minutos para eliminar las bacterias sueltas de la superficie. Para preparar el reactivo de disociación celular enzimática, diluir la dispasa de colagenasa en PBS a una concentración final de un miligramo por mililitro. Mezclar 95% de volumen de la solución enzimática preparada y 5% de volumen de FBS.
Luego preenfrió la centrífuga a cuatro grados centígrados antes de su uso. Para la disección de tejidos, coloque el pez sacrificado en hielo y recoja de tres a cuatro centímetros de la sección media de los intestinos. Extirpar la grasa y el mesenterio con fórceps.
Retire la grasa adherida a la superficie intestinal y la mucosa transparente elástica y maleable. Enjuague suavemente el fragmento de intestino con PBS helada estéril usando una jeringa para lavar el contenido intestinal y el moco. Después de varios lavados, diseccionar el fragmento en trozos pequeños y transferirlos a un tubo de 1,5 mililitros que contenga un mililitro de PBS helado.
Centrifugar la mezcla a 300 x g en cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Y reemplace el sobrenadante con un mililitro de hielo frío 0.08% BSA-DPBS. Usando una pipeta de vidrio aspirar suavemente para resuspender los fragmentos de tejido.
Después de lavar las piezas una vez más, retire el sobrenadante y agregue un mililitro del reactivo de disociación enzimática preparado. También mezcle cinco microlitros de inhibidor de ARN con el reactivo de disociación para la secuenciación de ARN de una sola célula. Coloque el tubo a 37 grados centígrados en baño de agua templada e invierta manualmente el tubo cada cinco minutos durante el tiempo de incubación de 30 a 60 minutos.
Una vez que los tubos estén girados, retire el reactivo de disociación celular enzimática utilizando puntas de gran calibre. Agregue un mililitro de BSA-DPBS helado al 0,08% y pipete suavemente las células hacia arriba y hacia abajo para evitar la interrupción celular. Después de la centrifusión y la resuspensión de las células una vez más, coloque el filtro celular de 40 micrómetros prehumedecido con BSA-DPBS al 0,08% en un tubo cónico de 50 mililitros.
Pase la suspensión celular a través del filtro. Golpee el colador, luego enjuáguelo con 200 microlitros DPBS y recoja la suspensión en el fondo del tubo. Después de transferir la suspensión a un tubo de 1,5 mililitros, agregue cinco microlitros de ADN e incube la suspensión durante 15 minutos a 15 a 20 grados centígrados.
Una vez centrifugado, retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 400 microlitros de DPBS helado sin iones de calcio y magnesio. Luego pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo con puntas de gran calibre para mezclar las células y repetir este proceso una vez más. Para la tinción, mezclar la suspensión celular en solución azul de tripano al 0,4% en una proporción igual e incubar durante tres minutos a temperatura ambiente.
Luego agregue 10 microlitros de la mezcla en el portaobjetos de vidrio. Cuente las células viables y muertas bajo el microscopio en tres campos y calcule el porcentaje de viabilidad celular. Se compararon las eficiencias de disociación de varias enzimas de uso común.
Se verificó que la mezcla de colagenasa dispasa tenía un mejor efecto de disociación que la dispasa de colagenasa o tripsina sola y varias otras mezclas de enzimas. El examen microscópico mostró que las células intestinales tenían alta viabilidad y se dispersaban como células individuales. La mayoría de las células eran viables, mientras que algunas estaban teñidas muertas debido a la membrana celular permeable.
Preste atención al tipo de PBS utilizado. La solución de digestión enzimática no se puede usar con PBS libre de calcio / magnesio ya que la enzima requiere iones de calcio / magnesio para funcionar de manera efectiva. El procedimiento facilita los estudios a nivel de una sola célula en especies de peces de acuicultura, proporcionando una referencia valiosa para el desarrollo de protocolos de disociación celular de especies de peces de acuicultura.
