Este protocolo fácil y reproducible se utilizó con éxito para aislar núcleos de alta calidad de hígados modelo de ratón sanos y enfermos, así como hígados de primates humanos y no humanos. Este método requiere solo una pequeña cantidad de material de tejido congelado. Además, la incentivación de grado de densidad proporciona una suspensión nuclear muy limpia con todos los tipos de células principales en el hígado conservados en la preparación nuclear final.
Este método de extracción de núcleos se puede utilizar en muestras de hígado humano bioarchivadas que se almacenan en biobancos. Comience la homogeneización del tejido cortando una pieza cúbica de 2230 miligramos o cinco milímetros de un tejido hepático colocado en la placa de Petri en hielo seco con un bisturí preenfriado. Transfiera inmediatamente la placa de Petri al hielo húmedo y agregue un mililitro de tampón de homogeneización.
Usando el bisturí frío, pica el tejido tanto como sea posible, permitiendo que aspire con una punta de orificio de un mililitro de ancho. Recoja la suspensión de tejido y transfiérala a un homogeneizador de vidrio de dos mililitros preenfriado. Lave la placa de Petri con 0,521 mililitros adicionales de tampón de homogeneización y recoja todas las piezas de tejido restantes mientras mantiene todo en hielo.
Realice lenta y cuidadosamente cinco golpes con mortero suelto A sobre hielo sin crear burbujas. Asegúrese de que el mortero se mueva cuidadosamente de la parte superior a la inferior del homogeneizador con cada golpe. Posteriormente, realice de 10 a 15 movimientos lentos con mortero B apretado sobre hielo sin crear burbujas.
Una vez hecho esto, filtre el homogeneizado a través de un filtro celular de 50 micrómetros mientras lo transfiere a un tubo de 1,5 mililitros preenfriado. Use más de un filtro o tubo para homogeneizados que contengan una gran cantidad de grupos de tejido conectivo. Enjuague el homogeneizador y los filtros con un tampón de homogeneización adicional de 0,521 mililitros para recoger completamente todos los homogeneizados de tejido antes de la centrifugación por gradiente de densidad.
Para la centrifugación por gradiente de densidad, centrifugar el homogeneizado filtrado en una centrífuga de ángulo fijo preenfriada a 1000 G durante ocho minutos a cuatro grados centígrados. Mientras la muestra se centrifuga, prepare un tubo de 1.5 mililitros que contenga 250 microlitros de dilución de iodixanol al 50% y un tubo de dos mililitros que contenga 500 microlitros de dilución de iodixanol al 29%. Coloque ambos tubos sobre hielo.
Luego, desde la suspensión de la centrífuga, aspire el sobrenadante sin alterar el pellet con una bomba de vacío. Vuelva a suspender el pellet en 250 microlitros de tampón de homogeneización utilizando la punta de pipeta de orificio de un mililitro de ancho. Luego transfiera 250 microlitros de la suspensión de núcleos a un tubo preenfriado de 1.5 mililitros que contenga 250 microlitros de 50% de iodixanol y mezcle suave y completamente para generar una suspensión de núcleos de yodoxanol al 25%.
A continuación, transfiera 500 microlitros de la suspensión de núcleos de iodixanol al 25% en un tubo de mililitro preenfriado que contenga 500 microlitros de dilución de iodixanol al 29%. Centrifugar el tubo en una centrífuga de cucharón oscilante preenfriada a 12, 500 G durante 20 minutos, con la pausa apagada. Justo antes de completar el paso de centrifugación, agregue los inhibidores de ARN al búfer de almacenamiento de núcleos, o NSB, mientras continúa con las tuberías de secuenciación de ARN de núcleo único.
Después de completar la centrifugación, aspirar el sobrenadante sin alterar el pellet con una bomba de vacío. Vuelva a suspender suavemente el pellet en 100 a 300 microlitros de NSB usando la punta de pipeta de orificio de un mililitro de ancho y transfiera la suspensión de núcleos a un tubo limpio de 1.5 mililitros preenfriado. Contar los núcleos usando solución de azul de tripano con un hemocitómetro manual e inmediatamente usar la suspensión de núcleos obtenida para el ensayo de genómica de núcleo único.
Para la clasificación celular basada en citometría de flujo, filtre la suspensión de núcleos a través de un filtro de 50 micrómetros en un tubo de fax o clasificación celular activada por fluorescencia de cinco mililitros preenfriada. Utilice un clasificador de citometría de flujo equipado con una boquilla de 100 micrómetros y cargue el tubo de fax en el clasificador antes de obtener una vista previa de la muestra. Configure la estrategia de compuerta para la clasificación de núcleos, comenzando con una puerta de dispersión trazando el área de dispersión hacia adelante frente al área de dispersión lateral, seguida de altura falsa frente a área falsa, y luego ancho falso versus área falsa.
Visualice el perfil de ploidía de los núcleos en el histograma del área falsa. Para clasificar en placas de 96 o 384 pocillos, ajuste el retardo de gotas y optimice la alineación de la placa utilizando el método colormétrico. Ajuste el enfriamiento de la muestra y el soporte de la placa a cuatro grados centígrados con la rotación de la muestra activada a 300 RPM.
Ordene los núcleos individuales a una concentración de muestra de aproximadamente una vez de 10 a cinco núcleos por mililitro con un caudal de 200 a 500 eventos por segundo. El examen microscópico de los núcleos extraídos de hígados congelados mostró que el paso de centrifugación del gradiente de densidad facilitó enormemente la eliminación de restos celulares y tisulares no deseados. Esta metodología preservó todos los niveles de ploidía, que fue validada y cuantificada por análisis citométrico.
Se observaron métricas de alta calidad a partir de los datos obtenidos mediante extracción de núcleos. La aproximación y proyección uniforme de la variedad representó el número de recuentos en todos los núcleos y los principales tipos de células, que solo pueden identificarse con confianza con el transcriptoma nuclear y la secuenciación relativamente superficial. Este enfoque permitió la investigación de factores de transcripción específicos del hígado y genes diana posteriores implicados en el metabolismo de los xenobióticos.
El patrón complementario de genes distintivos como el CYP2E1 percentral y el periportal CYP2F2 mostró que los núcleos extraídos retenían información crítica sobre la donación de hígado. La biblioteca de expresión génica del ARN se secuenció a una profundidad de 44.600 lecturas por núcleo y la biblioteca ATAC a una profundidad de 43.500 lecturas por núcleo. Un análisis ponderado del vecino más cercano realizado para múltiples mediciones de ambas modalidades, ARN más ATAC, utilizando los paquetes Seurat y Signac permitió la identificación y anotación de los tipos de células hepáticas mayores y menores sin sesgos prominentes debido al tamaño de la célula o la fragilidad nuclear.
Los reguladores transcripcionales aguas arriba y los genes distintivos de la donación hepática también se detectaron en este método. Es importante evitar crear demasiadas burbujas durante la homogeneización del plumón al mover los morteros hacia arriba y hacia abajo, y atenerse al número de golpes indicado en el protocolo.
