La preparación de una sola célula o una sola suspensión de núcleos es un paso crítico para el perfilado de transcriptoma y epigenoma de alto rendimiento. Nuestro protocolo proporciona un método simple, reproducible y universal para el aislamiento de núcleos únicos. A diferencia de otros métodos que requieren detergente para el aislamiento de núcleos, nuestro protocolo está basado en columnas, que es detergente y libre de enzimas.
Permite el aislamiento de núcleos en menos de 30 minutos. Nuestro protocolo simplifica el aislamiento de los núcleos. Proporciona un método robusto para preparar la suspensión de un solo núcleo a partir de tejidos difíciles de disociar.
Para empezar, pre-enfríe el tampón A y B de un kit de aislamiento de núcleos libre de detergente colocándolos sobre hielo durante al menos 30 minutos. Recubrir tubos y puntas de pipeta con solución 5%BSA, lo que mejorará la recuperación de los núcleos. Para cubrir las puntas de la pipeta, pipetee la solución 5%BSA de dos a tres veces y séquelas al aire durante dos horas.
Para recubrir los tubos, llénelos con BSA e inviertalos tres veces. Retire la solución y seque al aire los tubos boca abajo en un papel de tejido limpio durante dos horas. Recubrir un tubo de recogida y un tubo de 1,5 mililitros por muestra.
Utilice fórceps para abrir suavemente el cráneo y eliminar los tejidos blandos, la piel y los huesos de los lados ventral y dorsal del cráneo. Luego transfiera suavemente el cerebro a un plato de 30 milímetros que contenga PBS helado y picar el cerebro en trozos pequeños usando una cuchilla de afeitar. Para aislar núcleos individuales, transfiera el tejido picado al cartucho de filtro suministrado en el kit de aislamiento de núcleos y elimine el exceso de solución y agregue 200 microlitros de tampón frío A.Grind el tejido con una varilla de plástico durante dos minutos.
Agregue 300 microlitros de tampón frío A al cartucho del filtro e inci injeguelo con la tapa abierta durante 10 minutos. A continuación, tapone el cartucho y resuspender el tejido invirtiendo el tubo cinco veces. Centrifugar el tubo de muestra a 16.000 veces g durante 30 segundos para romper las células.
El flujo a través contiene núcleos intactos, que forman un pellet incoloro en la parte inferior del tubo. Deseche el filtro y luego resuspender el pellet por vórtice vigorosamente durante 10 segundos. Pele el núcleo de nuevo centrifugando la solución a 500 veces g durante tres minutos.
A continuación, deseche cuidadosamente el sobrenadante. Resuspender el pellet en 0,8 mililitros de tampón frío B pipeteando de dos a tres veces y centrifugar los núcleos a 600 veces g durante 10 minutos, lo que los separará de los desechos de la membrana. Deseche cuidadosamente el sobrenadante.
Resuspender los núcleos aislados en 500 microlitros de PBS con 5%BSA y mantener la suspensión sobre hielo hasta FACS. Para confirmar la morfología nuclear con tinción HEX, transfiera 100 microlitros de la suspensión de núcleos individuales a un tubo nuevo utilizando las puntas recubiertas de BSA. Manche los núcleos añadiendo 0,1 microlitrotro de HEX y vórtice suavemente el tubo.
Transfiera la suspensión de núcleos a una placa inferior de vidrio y la imagen de los núcleos utilizando un microscopio de fluorescencia con un ajuste de excitación láser de 405 nanómetros. Antes de realizar FACS, filtre los núcleos con un colador celular de 40 micrómetros en un tubo recubierto de BSA. Diluir la suspensión filtrada añadiendo PBS con 5%BSA a un volumen final de 1.000 microlitros.
Etiqueta dos tubos FACS inferiores redondos como control y teñidos y transfieren 250 microlitros de la suspensión de núcleos al tubo de control utilizando una punta de pipeta recubierta de BSA. Transfiera los 750 microlitros restantes de la solución al tubo FACS etiquetado como teñido y agregue un microlitros de tinte HEX para manchar los núcleos. A continuación, mezclarlo por vórtice lento.
Cargue el ejemplo de control no detenido en el clasificador de celdas y registre 5.000 eventos. A continuación, cargue la muestra manchada y registre 5.000 eventos. Dibuje puertas FACS para la identificación de núcleos individuales.
Los núcleos se pueden seleccionar comparando la señal fluorescente HEX entre las muestras de control y manchadas. A continuación, clasifúle núcleos positivos HEX del tubo teñido en un nuevo tubo de 1,5 mililitros que contenga 50 microlitros de PBS con 5%BSA. Este protocolo se utilizó para generar la suspensión de un solo núcleo directamente a partir del tejido cerebral del pez cebra.
Los núcleos aislados se teñiron con HEX y se visualizaron con microscopía de fluorescencia. Aparecieron intactos, redondos y bien separados. Es importante destacar que la agregación nuclear estaba ausente.
El enriquecimiento de núcleos aislados se realizó con citometría de flujo mediante el gating en la presencia de una señal fluorescente HEX. Los núcleos sin mancha mostraban fluorescencia de fondo mientras que los núcleos manchados mostraban una fuerte señal de fluorescencia. Los núcleos sin manchar y manchados estaban bien segregados en el canal violeta.
Al intentar este protocolo, es importante recordar que los núcleos individuales tienden a pegarse en un material plástico. Para evitar la posible pérdida de núcleos y aumentar la eficiencia, se recomienda el recubrimiento básico del material plástico. La suspensión aislada de núcleos individuales se puede utilizar aún más para el ARN de núcleos individuales Esta técnica aclara la heterogeneidad celular en sistemas biológicos complejos y ayuda a definir subtipos celulares y redes génicas.
El uso de un método libre de enzimas y detergente registra el ruido técnico y el sesgo introducidos durante la preparación de la muestra. Este método ha desarrollado un aislamiento simplificado y logístico de un solo núcleo.
