Este trabajo fue financiado por la Fundación de Amigos de Sophia (SSWO WAR-63).

Toda la cría y los experimentos de pez cebra se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices institucionales de la legislación Erasmus MC y de bienestar animal. El uso de larvas de pez cebra a los 5 días después de la fertilización entra en la categoría de experimentos que no requieren aprobación ética formal, como se describe en las regulaciones holandesas.
1. Obtención de larvas de tipo silvestre y tg (phox2bb:GFP) 5 días después de la fertilización (dpf)
<ol><li>Establecer la cría de peces cebra salvajes y recoger 50 huevos en medio E3 tamponado con HEPES (en lo sucesivo, E3) en una placa de Petri de 15 cm. Utilice estos peces como control negativo para la clasificación celular activada por fluorescencia (FAC).</li>
	<li>Establezca la cría de pez cebra tg (phox2bb: GFP) y recoja aproximadamente 300 huevos en E3 en una placa de Petri de 15 cm.</li>
	<li>Mantener los óvulos fecundados en E3 (máximo 50 huevos/plato) en un ciclo de luz/oscuridad de 14 h/10 h, en incubadora a 28,5 °C.</li>
	<li>A 1 dpf, retire los óvulos no fertilizados y deje que los fertilizados se desarrollen a 5 dpf.</li>
	<li>Seleccione larvas tg(phox2bb:GFP) a 1 dpf.</li>
</ol>2. Disociación de larvas enteras de tipo salvaje
<ol><li>Anestesiar larvas de 5 dpf con tricaína al 0,016%.</li>
	<li>Pica 30 peces cebra en trozos pequeños con una cuchilla de afeitar en una placa de Petri que contenga 1 ml de solución de tripsina-EDTA 10x.</li>
	<li>Transfiera el pez cebra picado a un tubo de microcentrífuga con un volumen total de 2 ml de solución de tripsina-EDTA 10x y déjelo en hielo durante 3 h. Pipetear hacia arriba y hacia abajo con una pipeta P1000 cada hora para estimular la disociación.</li>
</ol>3. Aislamiento intestinal
<ol><li>Colocar 6-10 larvas de 5 dpf anestesiadas con Tricaína al 0,016% seguidas, en una placa de agarosa al 1,8% (0,45 g de agarosa en 25 mL de E3), bajo un microscopio de disección</li>
	<li>Coloca un alfiler de insecto en la cabeza del pez cebra.</li>
	<li>Retire todo el E3 restante con un pañuelo de papel.</li>
	<li>Aísle el intestino con otro alfiler de insecto, sin perturbar ningún otro órgano. Asegúrese de retirar la yema (Figura complementaria S1A).</li>
	<li>Una vez aislado, inspeccione el intestino y retire todo el material no intestinal (por ejemplo, piel, grasa, hígado) si es necesario.</li>
	<li>Recoja el intestino con pinzas y colóquelo en un tubo de microcentrífuga, que contiene solución salina tamponada con fosfato (PBS) con suero fetal de ternero (FCS) al 10%, en hielo. NOTA: Se debe aislar un mínimo de 244 intestinos, manteniendo el tiempo total de disección en 3 h. Esto es factible con dos personas trabajando en paralelo.</li>
</ol>4. Disociación intestinal
<ol><li>Inmediatamente después de la disección de todos los intestinos, centrifugar el tubo de microcentrífuga a toda velocidad (13.800 × g) durante 30 s.</li>
	<li>Retire el PBS/FCS al 10% pero deje una pequeña cantidad (~100 μL) para evitar que los intestinos se sequen. Añadir 500 μL de 2,17 mg/mL de papaína en HBSS que contenga CaCl2 y MgCl2, para disociar las células.</li>
	<li>Activar la papaína con 2,5 μL de cisteína (1 M).</li>
	<li>Incubar las tripas al baño maría a 37 °C durante 10 min. Pipetear hacia arriba y hacia abajo hasta la mitad (después de 5 minutos) para estimular la digestión enzimática del tejido.</li>
	<li>Transfiera las células a un tubo FACS utilizando un filtro de células de 35 μm, prehumedecido con 0,5 ml de PBS/FCS al 10%.</li>
	<li>Lave el colador agregando un total de 2 ml de PBS/10% FCS en pasos de 0.5 ml.</li>
	<li>Centrifugar a 700 × g durante 5 min a 4 °C.</li>
	<li>Retirar el sobrenadante y resuspender el pellet en 300 μL de PBS/10% FCS.</li>
	<li>Añadir 1 μg/ml de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para marcar las células muertas (1:1.000) e incubar durante 5 min para permitir su exclusión durante el FACS.</li>
</ol>5. Enriquecimiento de FACS
<ol><li>Utilice la muestra de tipo salvaje para establecer las puertas de la población de células ordenadas registrando 3.000 células en el citómetro de flujo (Figura complementaria S1B-E).</li>
	<li>Utilice una boquilla de 100 μm, ajuste la precisión de clasificación en función de la pureza y coloque el tubo de recolección que contiene 200 μL de PBS / 5% FCS, en la máquina FACS.</li>
	<li>Cargue la suspensión celular de los intestinos y clasifique las células individuales vivas (DAPI-negativas) en el tubo de recolección (Figura 2C), excluyendo los dobletes (Figura 2B) y las células muertas (Figura 2C). NOTA: Para el pez cebra tg(phox2bb), la proporción de células GFP+ sólo se comprueba como referencia, ya que todas las células vivas individuales están clasificadas.</li>
	<li>Mantenga el tubo de recolección en hielo después de la clasificación de células.</li>
	<li>Cuente la suspensión celular con un hemocitómetro, incluyendo una verificación de viabilidad con azul de tripano. Si la viabilidad es de al menos el 80%, continúe con el siguiente paso.</li>
	<li>Las células ahora están listas para procesar para scRNAseq (es decir, la plataforma 10x Genomics Chromium). Utilice aproximadamente 20.000 células por muestra.</li>
</ol>

Procesamiento de células intestinales de larvas de pez cebra para la secuenciación de ARN unicelular

<ol>
	<li>Saldana-Morales, F. B., Kim, D. V., Tsai, M. T., Diehl, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Healthy+intestinal+function+relies+on+coordinated+enteric+nervous+system,+immune+system,+and+epithelium+eesponses.">Healthy intestinal function relies on coordinated enteric nervous system, immune system, and epithelium eesponses.</a> Gut Microbes. 13 (1), 1-14 (2021).</li><li>Sitrin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Gastrointestinal System. , (2014).</li><li>Furness, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+organisation+of+the+autonomic+nervous+system:+peripheral+connections.">The organisation of the autonomic nervous system: peripheral connections.</a> Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical. 130 (1-2), 1-5 (2006).</li><li>Furness, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+enteric+nervous+system+and+neurogastroenterology.">The enteric nervous system and neurogastroenterology.</a> Nature Reviews. Gastroenterology &amp; Hepatology. 9 (5), 286-294 (2012).</li><li>Obata, Y., Pachnis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+microbiota+and+the+immune+system+on+the+development+and+organization+of+the+enteric+nervous+system.">The effect of microbiota and the immune system on the development and organization of the enteric nervous system.</a> Gastroenterology. 151 (5), 836-844 (2016).</li><li>Heuckeroth, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hirschsprung+disease+-+integrating+basic+science+and+clinical+medicine+to+improve+outcomes.">Hirschsprung disease - integrating basic science and clinical medicine to improve outcomes.</a> Nature Reviews. Gastroenterology &amp; Hepatology. 15 (3), 152-167 (2018).</li><li>Antonucci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+intestinal+pseudo-obstruction.">Chronic intestinal pseudo-obstruction.</a> World Journal of Gastroenterology. 14 (19), 2953-2961 (2008).</li><li>De Giorgio, R., Sarnelli, G., Corinaldesi, R., Stanghellini, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+our+understanding+of+the+pathology+of+chronic+intestinal+pseudo-obstruction.">Advances in our understanding of the pathology of chronic intestinal pseudo-obstruction.</a> Gut. 53 (11), 1549-1552 (2004).</li><li>Bianco, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+neuromyopathies:+highlights+on+genetic+mechanisms+underlying+chronic+intestinal+pseudo-obstruction.">Enteric neuromyopathies: highlights on genetic mechanisms underlying chronic intestinal pseudo-obstruction.</a> Biomolecules. 12 (12), 1849 (2022).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+human+disease:+zebrafish+swim+into+view.">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nature Reviews. Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).</li><li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li><li>Wallace, K. N., Akhter, S., Smith, E. M., Lorent, K., Pack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+growth+and+differentiation+in+zebrafish.">Intestinal growth and differentiation in zebrafish.</a> Mechanisms of Development. 122 (2), 157-173 (2005).</li><li>Wallace, K. N., Pack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+and+conserved+aspects+of+gut+development+in+zebrafish.">Unique and conserved aspects of gut development in zebrafish.</a> Developmental Biology. 255 (1), 12-29 (2003).</li><li>Harrison, C., Wabbersen, T., Shepherd, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+visualization+of+the+development+of+the+enteric+nervous+system+using+a+Tg(-8.3bphox2b:Kaede)+transgenic+zebrafish.">In vivo visualization of the development of the enteric nervous system using a Tg(-8.3bphox2b:Kaede) transgenic zebrafish.</a> Genesis. 52 (12), 985-990 (2014).</li><li>Kuil, L. E., Chauhan, R. K., Cheng, W. W., Hofstra, R. M. W., Alves, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish:+a+model+organism+for+studying+enteric+nervous+system+development+and+disease.">Zebrafish: a model organism for studying enteric nervous system development and disease.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 629073 (2020).</li><li>Stuart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+Integration+of+Single-Cell+Data.">Comprehensive Integration of Single-Cell Data.</a> Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).</li><li>Kuil, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+characterization+of+the+larval+zebrafish+enteric+nervous+system+at+a+single+cell+transcriptomic+level.">Unbiased characterization of the larval zebrafish enteric nervous system at a single cell transcriptomic level.</a> iScience. 26 (7), 107070 (2023).</li><li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+differential+transcriptomes+and+cell+types+in+zebrafish+larvae+intestine+and+liver.">Unraveling differential transcriptomes and cell types in zebrafish larvae intestine and liver.</a> Cells. 11 (20), 3290 (2022).</li><li>Jin, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdx1b+protects+intestinal+cell+fate+by+repressing+signaling+networks+for+liver+specification.">Cdx1b protects intestinal cell fate by repressing signaling networks for liver specification.</a> Journal of Genetics and Genomics. 49 (12), 1101-1113 (2022).</li><li>Willms, R. J., Jones, L. O., Hocking, J. C., Foley, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell+atlas+of+microbe-responsive+processes+in+the+zebrafish+intestine.">A cell atlas of microbe-responsive processes in the zebrafish intestine.</a> Cell Reports. 38 (5), 110311 (2022).</li><li>Kline, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fishing for answers: Isolating enteric neurons and identifying putative ENS mutants. , (2016).</li><li>Allan, K., DiCicco, R., Ramos, M., Asosingh, K., Yuan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+a+single+cell+suspension+from+zebrafish+retinal+tissue+for+flow+cytometric+cell+sorting+of+Muller+glia.">Preparing a single cell suspension from zebrafish retinal tissue for flow cytometric cell sorting of Muller glia.</a> Cytometry A. 97 (6), 638-646 (2020).</li><li>Lopez-Ramirez, M. A., Calvo, C. F., Ristori, E., Thomas, J. L., Nicoli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+zebrafish+brain-derived+neurospheres.">Isolation and culture of adult zebrafish brain-derived neurospheres.</a> Journal of Visualized Experiments. 53617 (108), 53617 (2016).</li></ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Aquí, presentamos un método para el aislamiento y disociación del intestino de larvas de pez cebra de 5 dpf utilizando FACS. Con este método, se recolectaron y analizaron con éxito diferentes tipos de células intestinales mediante scRNA-seq, utilizando la plataforma 10x Genomics Chromium. Seleccionamos la línea de pez cebra tg(phox2bb:GFP), ya que queríamos una indicación de que las células viables del SNE también se aislarían (Figura 2D). Sin embargo, es importante tene...

El tracto gastrointestinal (GI) es un sistema complejo que desempeña un papel vital en la salud y el bienestar general. Es responsable de la digestión y absorción de nutrientes, así como de la eliminación de productos de desecho 1,2. El tracto gastrointestinal está compuesto por múltiples tipos de células, incluidas las células epiteliales, las células del músculo liso, las células inmunitarias y el sistema nervioso entérico (SNE), que se comunican estrechamente entre sí para regular y mantener una función intestinal adecuada 3,4,5. Los defectos en el desarrollo del tracto gastrointestinal pueden tener efectos de gran alcance en diversos aspectos, como la absorción de nutrientes, la composición de la microbiota, el eje intestino-cerebro y el SNE, lo que conduce a varios trastornos neuromusculares entéricos, como la enfermedad de Hirschsprung y la pseudoobstrucción intestinal crónica 6,7. Estos trastornos se caracterizan por una dismotilidad intestinal severa causada por alteraciones en varias células clave, como las células intersticiales de Cajal, las células musculares lisas y el SNE 6,8,9. Sin embargo, los mecanismos moleculares que subyacen al desarrollo y la disfunción gastrointestinal aún no se conocen bien.
El pez cebra es un organismo modelo valioso para estudiar el desarrollo y la disfunción gastrointestinal debido a su rápido desarrollo embrionario, transparencia durante las etapas embrionaria y larvaria, y trazabilidad genética 10,11,12,13,14. Se dispone de numerosas líneas transgénicas de pez cebra que expresan proteínas fluorescentes. Un ejemplo de este tipo de línea es el pez cebra tg(phox2bb:GFP), comúnmente utilizado para estudiar el SNE, ya que todas las células phox2bb+, incluidas las neuronas entéricas, están marcadas como15,16. Aquí, utilizando la línea de pez cebra tg(phox2bb:GFP), presentamos un método para el aislamiento intestinal de larvas 5 días después de la fertilización (dpf) para el análisis de secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq) (Figura 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x Trypsin (0.5%)-EDTA (0.2%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>59418C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL round bottom tube with cell-strainer cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Falcon Round-Bottom Tube 5 mL (FACS tubes) snap cap</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Ranger v3.0.2</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat#D-9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td>Olympus SZX16</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria III sorter machine</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS with CaCl2 and MgCl2</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26000-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS-222, Tricaine</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>A5040-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seurat v3</td>
			<td>Stuart et&#160;al. (2019)</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>Cat#T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gut isolation from zebrafish larvae for single-cell rna sequencing

El tracto gastrointestinal (GI) realiza una serie de funciones esenciales para la vida. Los defectos congénitos que afectan a su desarrollo pueden dar lugar a trastornos neuromusculares entéricos, lo que pone de manifiesto la importancia de comprender los mecanismos moleculares que subyacen al desarrollo y la disfunción gastrointestinal. En este estudio, presentamos un método para el aislamiento intestinal de larvas de pez cebra a los 5 días después de la fertilización para obtener células vivas y viables que se pueden utilizar para el análisis de secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq). Este protocolo se basa en la disección manual del intestino del pez cebra, seguida de la disociación enzimática con la papaína. Posteriormente, las células se someten a una clasificación celular activada por fluorescencia y las células viables se recolectan para la secuenciación de scRNA. Con este método, pudimos identificar con éxito diferentes tipos de células intestinales, incluidas las células epiteliales, estromales, sanguíneas, musculares e inmunitarias, así como las neuronas entéricas y la glía. Por lo tanto, consideramos que es un recurso valioso para estudiar la composición del tracto gastrointestinal en la salud y la enfermedad, utilizando el pez cebra.

The gastrointestinal (GI) tract is a complex system that plays a vital role in overall health and well-being. It is responsible for the digestion and absorption of nutrients, as well as the elimination of waste products1,2. The GI tract is composed of multiple cell types, including epithelial cells, smooth muscle cells, immune cells, and the enteric nervous system (ENS), which communicate closely together to regulate and maintain proper intestinal function3,4,5. Defects in the development of the GI tract can have far-reaching effects on various aspects such as nutrient absorption, microbiota composition, the gut-brain axis, and the ENS, leading to several enteric neuromuscular disorders, such as Hirschsprung disease and Chronic intestinal pseudo-obstruction6,7. These disorders are characterized by severe gut dysmotility caused by alterations in various key cells, such as the interstitial cells of Cajal, smooth muscle cells, and the ENS6,8,9. However, the molecular mechanisms underlying GI development and dysfunction are still poorly understood.
The zebrafish is a valuable model organism for studying GI development and dysfunction due to its rapid embryonic development, transparency during embryonic and larval stages, and genetic tractability10,11,12,13,14. Numerous transgenic zebrafish lines expressing fluorescent proteins are available. An example of such a line is the tg(phox2bb:GFP) zebrafish, commonly used to study the ENS, as all phox2bb+ cells, including enteric neurons, are labeled15,16. Here, using the tg(phox2bb:GFP) zebrafish line, we present a method for intestinal isolation of 5 days post fertilization (dpf) larvae for single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) analysis (Figure 1).

Autor destacado: Aislamiento y análisis de células intestinales de larvas de pez cebra para investigar los aspectos transcriptómicos del desarrollo gastrointestinal 

Aislamiento intestinal de larvas de pez cebra para la secuenciación de ARN de una sola célula

Our research aims to investigate the transcriptomic changes occurring during gastrointestinal development and dysfunction in zebrafish larvae. Here, we provide a new protocol that allows isolation of different cell types within the zebrafish intestine, which has potential applications in understanding gastrointestinal health and disease. In recent years, there has been growing interest in exploring the interaction between the enteric nervous system and other intestinal cell types during development and disease.Understanding these complex dynamics using advanced techniques like single-cell RNA sequencing, holds the potential to reveal critical insights into enteric neuromyopathies, leading to more precise diagnostics and treatments. Using this protocol, we successfully identified various intestinal cell types, including epithelial, stromal, bloods, muscle, immune cells, and even enteric neurons and glia, which have not been captured before at this amount using similar approaches. Thus, we provide a reliable technique to study the gastrointestinal composition during development and dysfunction.

Con este protocolo, logramos aislar y disociar con éxito intestinos enteros de larvas de 5 dpf. Utilizando papaína como enzima de disociación, mejoramos significativamente la viabilidad celular, permitiendo la captura de 46.139 eventos que involucraron células individuales viables (6,4% de todas las células) de 244 intestinos aislados (Figura 2A). Se utilizaron larvas enteras de tipo salvaje como control para garantizar que se optimizara el proceso de clasificación, lo que permitió un...

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Aquí, describimos un método para el aislamiento intestinal de larvas de pez cebra a los 5 días después de la fertilización, para el análisis de secuenciación de ARN de una sola célula.

The gastrointestinal (GI) tract performs a range of functions essential for life. Congenital defects affecting its development can lead to enteric ...

Nuestra investigación tiene como objetivo investigar los cambios transcriptómicos que ocurren durante el desarrollo gastrointestinal y la disfunción en larvas de pez cebra. Aquí, proporcionamos un nuevo protocolo que permite el aislamiento de diferentes tipos de células dentro del intestino del pez cebra, que tiene aplicaciones potenciales en la comprensión de la salud y las enfermedades gastrointestinales. En los últimos años, ha habido un creciente interés en explorar la interacción entre el sistema nervioso entérico y otros tipos de células intestinales durante el desarrollo y la enfermedad.La comprensión de esta compleja dinámica mediante técnicas avanzadas, como la secuenciación de ARN de una sola célula, tiene el potencial de revelar información crítica sobre las neuromiopatías entéricas, lo que conduce a diagnósticos y tratamientos más precisos. Utilizando este protocolo, identificamos con éxito varios tipos de células intestinales, incluidas las epiteliales, estromales, sanguíneas, musculares, células inmunitarias e incluso neuronas entéricas y glía, que no se habían capturado antes en esta cantidad utilizando enfoques similares. De este modo, proporcionamos una técnica fiable para estudiar la composición gastrointestinal durante el desarrollo y la disfunción.

gut-isolation-from-zebrafish-larvae-for-single-cell-rna-sequencing

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gut Isolation from Zebrafish Larvae for Single-cell RNA Sequencing

988 vistas.  Erasmus University Medical Center - Sophia Children's Hospital. Nuestra investigación tiene como objetivo investigar los cambios transcriptómicos que ocurren durante el desarrollo gastrointestinal y la disfunción en larvas de pez cebra. Aquí, proporcionamos un nuevo protocolo que permite el aislamiento de diferentes tipos de células dentro del intestino del pez cebra, que tiene aplicaciones potenciales en la comprensión de la salud y las enfermedades gastrointestinales. En los últimos años, ha habido un creciente interés en explorar la interacci?...

Video: Autor destacado: Aislamiento y análisis de células intestinales de larvas de pez cebra para investigar los aspectos transcriptómicos del desarrollo gastrointestinal 

The gastrointestinal (GI) tract performs a range of functions essential for life. Congenital defects affecting its development can lead to enteric neuromuscular disorders, highlighting the importance to understand the molecular mechanisms underlying GI development and dysfunction. In this study, we present a method for gut isolation from zebrafish larvae at 5 days post fertilization to obtain live,&#160;viable cells which can be used for single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) analysis. This protocol is based on the manual dissection of the zebrafish intestine, followed by enzymatic dissociation with papain. Subsequently, cells are submitted to fluorescence-activated cell sorting, and viable cells are collected for scRNA-seq. With this method, we were able to successfully identify different intestinal cell types, including epithelial, stromal, blood, muscle, and immune cells, as well as enteric neurons and glia. Therefore, we consider it to be a valuable resource for studying the composition of the GI tract in health and disease, using the zebrafish.

Here, we describe a method for gut isolation from zebrafish larvae at 5 days post fertilization, for single-cell RNA sequencing analysis.

Investigación

Biología del Desarrollo

Obtaining Wildtype and Transgenic Zebrafish Larvae and WildType Whole Larvae Dissociation

Begin by obtaining the wildtype and transgenic zebrafish eggs from the respective breeding setup. Take a 15-centimeter Petri dish containing HEPES-buffered E3 medium or E3.And collect the appropriate amount of fertilized eggs from the desired zebrafish breeding setup. Incubate the fertilized eggs in E3 at 28 degrees Celsius with an appropriate light and dark cycle.At one days post fertilization or dpf, remove any unfertilized eggs and let the fertilized ones develop until five dpf. Select the transgenic zebrafish larvae at one dpf. Before proceeding for whole larvae dissociation, anesthetize the five dpf wildtype larvae using 0.016%Tricaine, and transfer 30 anesthetized larvae into a Petri dish containing one milliliter of 10x trypsin-EDTA solution.Then, using a razor blade, chop the larvae into small pieces in the Petri dish. Transfer the chopped larvae into a micro centrifuge tube with two milliliters of 10x trypsin-EDTA solution, and leave the tube on ice for three hours. Pipette the contents up and down with a P1000 pipette every hour to stimulate dissociation.

Obtención de larvas de pez cebra silvestres y transgénicas y disociación de larvas enteras silvestres

Isolation and Dissociation of Gut from Zebrafish Larvae for FACS Enrichment of Gut Cells

To begin, prepare a 1.8%agarose plate with HEPES Buffered E3 medium or E3.While working under a dissection microscope, place six to 10 anesthetized larvae in a row on the agarose plate. Put one insect pin on the head of each larvae. Then remove the remaining E3 from the plate using a tissue.Using another insect pin, isolate the intestine from a larvae without disturbing any other organs. Ensure proper removal of yolk. Once isolated, inspect the intestine and remove all non-intestinal material, such as skin, fat, or liver.Use tweezers to collect the intestine and transfer it to PBS containing 10%FCS in a microcentrifuge tube placed on ice. Immediately after the dissection of all intestines, centrifuge the microcentrifuge tube at 13, 800 g for 30 seconds. Remove the supernatant, leaving about 100 microliters in the tube to prevent the intestines from drying out.Add 500 microliters of papain solution to the intestines in the tube. Activate the papain by adding 2.5 microliters of one molar cysteine. Then incubate the tube containing the intestines in a water bath at 37 degrees Celsius for 10 minutes.Pipette the contents up and down halfway after five minutes to stimulate enzymatic tissue digestion. Transfer the dissociated cells into a fluorescence-activated cell sorting, or FACS, tube through a pre-wedded 35-micron cell strainer. Wash the strainer several times by adding 0.5 milliliters of PBS containing 10%FCS to a total wash volume of two milliliters.Centrifuge the collected filtrate at 700 g for five minutes at 4 degrees Celsius, and remove the supernatant. Add one microgram per milliliter DAPI to 300 microliters of PBS containing 10%FCS. Add this mixture to the pellet and resuspend to label the dead cells.Then incubate for five minutes on ice to allow their exclusion during subsequent FACS analysis.

Aislamiento y disociación del intestino de las larvas de pez cebra para el enriquecimiento de células intestinales con FACS

FACS Enrichment of Zebrafish Gut Cell Suspension for scRNAseq

To perform fluorescence-activated cell sorting, or FACS, on the gut cells isolated from zebrafish larvae, use the wild-type whole larvae sample to set the gates of the sorted cell population by recording 3, 000 cells on the flow cytometer. Use a 100-micron nozzle and set Sort Precision to 4-Way Purity. Put the collection tube containing 200 microliters of PBS with 5%fetal calf serum in the fax machine.Load the cell suspension prepared from the isolated guts, and after excluding doublets in dead cells, sort live or DAPI-negative single cells into the collection tube. Keep the collection tube on ice after cell sorting, employing a viability check with trypan blue. Count the number of cells in the suspension with a hemocytometer.The cells are now ready to be processed for single-cell RNA sequencing. Use approximately 20, 000 cells per sample.