Los modelos de lesiones son indispensables para estudiar la regeneración in vivo, sin embargo, investigar la regeneración en el intestino ha demostrado ser un desafío técnico. La falta de protocolos de imagen longitudinales ha impedido una visión más profunda de la dinámica de la escala celular y tisular que orquesta la regeneración intestinal. En este protocolo, describimos un método de microscopía intravital que induce localmente daño tisular a escala de cripta única, y sigue la respuesta regenerativa del epitelio intestinal en el ratón vivo al daño de ablación con láser basado en fotones de una sola cripta o campos intestinales más grandes de una manera controlada en el tiempo y el espacio.
Las imágenes intravitales posteriores, repetitivas y a largo plazo permiten el seguimiento del área dañada a lo largo del tiempo y permiten el monitoreo de la dinámica de la cripta durante la recuperación del tejido durante un período de varias semanas. Inducir ratones inyectando tamoxifeno disuelto en aceite de girasol en cuatro a seis semanas antes de la cirugía. Aplique analgesia, inyecte 200 microlitros de buprenorfina por vía subcutánea 30 minutos antes de la cirugía.
Administrar carprofeno en agua potable 24 horas antes de la cirugía. Introduzca herramientas quirúrgicas estériles esterilizadas en autoclave en el gabinete de riesgo biológico. Encienda la almohadilla térmica y ajuste la temperatura a 37 grados centígrados.
Encienda la cámara de control de temperatura del microscopio al menos cuatro horas antes de la toma de imágenes. Mantenga la temperatura dentro de la cámara climática estable a 37 grados centígrados. Encienda el microscopio de dos fotones, el escáner y el láser.
Inicie el software de imágenes. Sintoniza la longitud de onda del láser a 960 nanómetros y abre el obturador. Anestesiar al ratón con dos a 3% de isoflurano, y colocarlo en una almohadilla térmica cubierta con un paño estéril.
Verifique la profundidad de la anestesia evaluando la frecuencia y la calidad de la respiración una respiración por segundo, y verificando el reflejo del ratón. Cubra los ojos del ratón con ungüento para los ojos. Inyecte 200 microlitros de solución salina estéril precalentada por vía subcutánea.
Afeitar el abdomen y eliminar el vello. Cambie el paño estéril en el área quirúrgica. Inserte la sonda rectal para controlar la temperatura del ratón.
La temperatura debe ser de aproximadamente 37 grados centígrados. Use un nuevo par de guantes estériles. Limpie el área quirúrgica de forma circular con exfoliantes alternos de solución antiséptica seguida de etanol al 80% tres veces.
Cubra el ratón con una cortina quirúrgica estéril. Compruebe el reflejo del ratón. Haga una incisión vertical de 10 milímetros en la línea media a través de la piel con un bisturí estéril.
Incise la línea alba usando las tijeras para separar los músculos abdominales rectos y abrir el abdomen. Encuentra el ciego del ratón usando un hisopo de algodón estéril empapado en solución salina precalentada para usarlo como punto de referencia. Haga un pequeño corte en un trozo de gasa, humedézcalo en solución salina estéril precalentada y colóquelo por encima de la incisión.
Saque el intestino con hisopos de algodón estériles empapados en solución salina estéril precalentada. Mantenga el intestino hidratado agregando solución salina precalentada esterilizada. Transfiera el ratón a una caja de imágenes estéril precalentada.
Coloque el intestino sobre el vidrio estéril. Coloque la cabeza del ratón dentro del tubo de inhalación de la caja de imágenes. Si es necesario, asegure el ratón con una película flexible estéril y cinta adhesiva.
Coloque la caja de imágenes que contiene el ratón en la cámara del microscopio. Controle al ratón durante la obtención de imágenes comprobando la frecuencia y la profundidad de la respiración, y la temperatura a través de una sonda rectal cada 15 minutos. El isoflurano debe mantenerse entre uno y 2%Encuentre una región en el intestino utilizando los IP del microscopio.
Obtenga una amplia vista de campo de la región de interés utilizando la cámara interna del microscopio. Imagen de la región de interés utilizando el láser de 960 nanómetros de microscopio multifotónico. Ajuste la potencia del láser y la longitud de onda de acuerdo con las fluoroformas utilizadas en el experimento.
En este ejemplo, las criptas expresadas en la membrana son proteínas fluorescentes rojas, y se marcan estocásticamente con proteína fluorescente verde tras la inducción con dosis finales bajas de tamoxifeno. Adquiera una pila Z de 10 a 20 pasos de tres micras de la región de interés. Elija una sola posición o varias posiciones de la imagen de mosaico anteriormente.
Utilice la función de calibración del punto de ruptura en el software de imágenes con una resolución de zoom de 32 y 124 por 124 píxeles con una velocidad de escaneo de 400 hercios utilizando la propiedad de escaneo bidireccional durante tres a 10 segundos, dependiendo del tamaño del daño al que se pretenda. El inicio del daño en el área de la cripta se puede reconocer por un aumento en la autofluorescencia tanto en el canal verde como en el rojo. Después de la ablación, adquiera pilas Z de las regiones dañadas para confirmar la ubicación y el alcance del daño.
Repita los dos pasos anteriores para varias regiones en el mismo ratón. Coloque el ratón mientras aún está bajo anestesia en un área de sutura estéril y cúbralo con una cortina estéril. Inserte el intestino expuesto de nuevo en el abdomen usando hisopos de algodón estériles empapados en solución salina estéril precalentada.
Suturar la línea alba realizando sutura continua simple utilizando sutura absorbible. Cierre las extremidades de la sutura con nudos quirúrgicos. Repita el mismo paso con la capa de piel.
Apague la estación de isoflurano, limpie y esterilice la caja de imágenes y la incrustación. Deje que el ratón se recupere de la cirugía mientras la jaula se coloca en la almohadilla térmica durante una hora. Inyecte 200 microlitros de buprenorfina por vía subcutánea de seis a 12 horas después de la cirugía.
Administrar carprofeno en agua potable durante 72 horas después de la cirugía. Pesar el ratón y controlar el bienestar todos los días durante una semana después de la cirugía. En el segundo punto de tiempo, al menos una semana después de la primera sesión de imágenes, repita la cirugía y las imágenes intravitales.
Utilice el patrón de vasos sanguíneos para encontrar la misma imagen de regiones de interés en el primer punto de tiempo. Si el ratón no está destinado a ser fotografiado en otro punto de tiempo, sacrifique el ratón realizando la dislocación cervical bajo anestesia. De lo contrario, continúe con el cierre del sitio quirúrgico y la atención posterior a la cirugía.
Los ratones K19-Cre ERT mTmG fueron inyectados con tamoxifeno para inducir el marcado estocástico de las células con GFP de cuatro a seis semanas antes de la cirugía y la primera sesión de imágenes. Después de exponer quirúrgicamente el intestino del ratón y adquirir imágenes de cámara y fluorescentes de la región de interés, la configuración del punto de ruptura del láser multifotón se utiliza para extirpar criptas. El inicio del daño puede reconocerse por un aumento de la autofluorescencia tanto en el canal verde como en el rojo.
El mismo procedimiento se repite un mes después, y la vasculatura se utiliza como un punto de referencia para encontrar de nuevo la misma región. Usando el modelo de confeti Lgr5-eGFP, las criptas etiquetadas con diferentes colores se pueden seguir a lo largo del tiempo para mapear la dinámica de la recuperación. En este ejemplo, las criptas en verde expresan el Lgr5 Cre, y una cripta en magenta está etiquetada con color confeti.
Se observan diferentes modos de regeneración dos semanas después de la ablación con láser. Algunas regiones permanecen sin cambios, mientras que otras regiones exhiben remodelación en formas de fisión de criptas, por lo que la división de una cripta en dos, o la fusión, la fusión de dos criptas en una, o la desaparición de la cripta. La ablación láser combinada con el método de microscopía intravital restringe el daño a una región de interés definida.
Esto nos permite controlar la ubicación del daño, así como la extensión del daño. La gravedad del daño se puede modular para extirpar criptas o campos intestinales completos para informarnos sobre la respuesta regenerativa a escala de cripta. Además del control espacial, la ablación con láser también permite cronometrar con precisión el inicio del daño, además de obtener imágenes del mismo órgano en condiciones homeostáticas y regeneradoras en el mismo ratón, superando así la precisión de los modelos de lesiones anteriores.
La aplicación de la ablación con láser y las imágenes intravitales repetitivas se pueden utilizar como plataforma para una multitud de preguntas de investigación y diversas áreas científicas que abarcan la regeneración, la inmunología y la investigación del cáncer.
