Yaralanma modelleri, in vivo rejenerasyonu incelemek için vazgeçilmezdir, ancak bağırsakta rejenerasyonu araştırmak teknik bir zorluk olduğu kanıtlanmıştır. Uzunlamasına görüntüleme protokollerinin eksikliği, bağırsak rejenerasyonunu düzenleyen hücre ve doku ölçeği dinamiklerine daha derin bir bakış açısı getirmiştir. Bu protokolde, tek kript ölçeğinde lokal olarak doku hasarını indükleyen ve canlı faredeki bağırsak epitelinin, tek kript veya daha büyük bağırsak alanlarının foton bazlı lazer ablasyon hasarına zaman ve mekan kontrollü bir şekilde rejeneratif tepkisini takip eden intravital bir mikroskopi yöntemini tanımlamaktayız.
Sonraki, uzun süreli, tekrarlayan intravital görüntüleme, zaman içinde hasarlı alanın izlenmesini sağlar ve birkaç haftalık bir süre boyunca doku iyileşmesi sırasında kript dinamiklerinin izlenmesine izin verir. Ayçiçek yağında çözünmüş tamoksifeni ameliyattan dört ila altı hafta öncesine enjekte ederek fareleri indükleyin. Analjezi uygulayın, ameliyattan 30 dakika önce deri altına 200 mikrolitre buprenorfin enjekte edin.
Ameliyattan 24 saat önce içme suyunda carprofen uygulayın. Biyolojik tehlike kabinine otoklavlanmış steril cerrahi aletleri tanıtın. Isıtma yastığını açın ve sıcaklığı 37 santigrat dereceye ayarlayın.
Görüntülemeden en az dört saat önce mikroskobun sıcaklık kontrol odasını açın. İklim odasının içindeki sıcaklığı 37 santigrat derecede sabit tutun. İki foton mikroskobu, tarayıcıyı ve lazeri açın.
Görüntüleme yazılımını başlatın. Lazerin dalga boyunu 960 nanometreye ayarlayın ve deklanşörü açın. Fareyi% iki ila% 3 izofluran kullanarak uyuşturun ve steril bir bezle kaplı bir ısıtma yastığına yerleştirin.
Saniyede bir nefes alma sıklığını ve kalitesini değerlendirerek ve farenin refleksini kontrol ederek anestezinin derinliğini kontrol edin. Farenin gözlerini göz merhemi ile örtün. Deri altından 200 mikrolitre önceden ısıtılmış steril salin enjekte edin.
Karnı tıraş edin ve saçları çıkarın. Ameliyat bölgesindeki steril bezi değiştirin. Farenin sıcaklığını izlemek için rektal probu takın.
Sıcaklık yaklaşık 37 santigrat derecede olmalıdır. Yeni bir çift steril eldiven giyin. Cerrahi alanı, alternatif antiseptik solüsyon fırçaları ve ardından üç kez% 80 etanol ile dairesel bir şekilde temizleyin.
Fareyi steril bir cerrahi örtü ile örtün. Farenin refleksini kontrol edin. Steril bir neşter kullanarak deriden 10 milimetrelik dikey orta hat kesisi yapın.
Rektus karın kaslarını ayırmak ve karnı açmak için makas kullanarak linea alba'yı kesin. Referans noktası olarak kullanmak için önceden ısıtılmış salin içinde ıslatılmış steril bir pamuklu çubuk kullanarak farenin çekumunu bulun. Gazlı bez parçasında küçük bir kesim yapın, önceden ısıtılmış steril salin içinde ıslatın ve insizyonun üzerine yerleştirin.
Önceden ısıtılmış steril salin içine batırılmış steril pamuklu çubuklarla bağırsağı çıkarın. Sterilize edilmiş, önceden ısıtılmış salin ekleyerek bağırsağı nemli tutun. Fareyi önceden ısıtılmış steril bir görüntüleme kutusuna aktarın.
Bağırsağı steril camın üzerine yerleştirin. Farenin kafasını görüntüleme kutusunun inhalasyon tüpünün içine yerleştirin. Gerekirse, fareyi steril esnek film ve bantla sabitleyin.
Fareyi içeren görüntüleme kutusunu mikroskop odasına yerleştirin. Her 15 dakikada bir rektal prob ile solunum sıklığını ve derinliğini ve sıcaklığı kontrol ederek görüntüleme sırasında fareyi izleyin. İzofluran% bir ila% 2 arasında tutulmalıdırMikroskopun IP'lerini kullanarak bağırsakta bir bölge bulun.
Mikroskopun dahili kamerasını kullanarak ilgilendiğiniz bölgenin geniş bir alan görünümünü elde edin. Çoklu foton mikroskobunun 960 nanometre lazerini kullanarak ilgilenilen bölgeyi görüntüleyin. Lazer gücünü ve dalga boyunu deneyde kullanılan floroformlara göre ayarlayın.
Bu örnekte, membran eksprese edilen kriptler kırmızı floresan proteinidir ve düşük uç dozda tamoksifen ile indüksiyon üzerine stokastik olarak yeşil floresan proteini ile etiketlenmiştir. İlgilenilen bölgenin üç mikronluk 10 ila 20 adımlı bir Z-yığını edinin. Daha önce kutucuk görüntüsünden tek bir konum veya birden fazla konum seçin.
Görüntüleme yazılımındaki ihlal noktası kalibrasyon işlevini, hedeflenen hasarın boyutuna bağlı olarak, çift yönlü tarama özelliğini kullanarak üç ila 10 saniye boyunca çift yönlü tarama özelliğini kullanarak 400 hertz tarama hızıyla yakınlaştırma 32 ve 124 x 124 piksel çözünürlükte kullanın. Kript alanındaki hasarın başlaması, hem yeşil hem de kırmızı kanaldaki otofloresandaki bir artışla tanınabilir. Ablasyondan sonra, hasarın yerini ve derecesini doğrulamak için hasarlı bölgelerin Z-yığınlarını edinin.
Aynı faredeki birden çok bölge için önceki iki adımı yineleyin. Fareyi hala anestezi altındayken steril bir dikiş alanına yerleştirin ve steril bir örtü ile örtün. Açıkta kalan bağırsağı, önceden ısıtılmış steril tuzlu suya batırılmış steril pamuklu çubuklar kullanarak tekrar karın içine yerleştirin.
Emilebilir sütür kullanarak basit sürekli dikiş yaparak linea alba'yı dikin. Dikişin ekstremitelerini cerrahi düğümlerle kapatın. Aynı adımı cilt tabakasıyla tekrarlayın.
İzofluran istasyonunu kapatın, görüntüleme kutusunu ve kakmayı temizleyin ve sterilize edin. Kafes bir saat boyunca ısıtma yastığına yerleştirilirken farenin ameliyattan kurtulmasına izin verin. Ameliyattan altı ila 12 saat sonra deri altına 200 mikrolitre buprenorfin enjekte edin.
Ameliyat sonrası 72 saat boyunca içme suyunda carprofen uygulayın. Fareyi tartın ve ameliyat sonrası bir hafta boyunca her gün refahı izleyin. İkinci zaman noktasında, ilk görüntüleme seansından en az bir hafta sonra, cerrahi ve intravital görüntülemeyi tekrarlayın.
İlk zaman noktasında aynı ilgi çekici bölgeleri bulmak için kan damarlarının modelini kullanın. Farenin başka bir zaman noktasında görüntülenmesi gerekmiyorsa, anestezi altında servikal çıkık yaparak fareyi kurban edin. Aksi takdirde ameliyat yerinin kapatılması ve ameliyat sonrası bakım ile devam edilir.
K19-Cre ERT mTmG farelere, ameliyattan ve ilk görüntüleme seansından dört ila altı hafta önce GFP'li hücrelerin stokastik etiketlenmesini indüklemek için tamoksifen enjekte edildi. Farenin bağırsağını cerrahi olarak açığa çıkardıktan ve ilgili bölgenin kamera ve floresan görüntülerini elde ettikten sonra, multifoton lazerin ihlal noktası ayarları kriptleri ablate etmek için kullanılır. Hasarın başlaması, hem yeşil hem de kırmızı kanaldaki otofloresandaki bir artışla tanınabilir.
Aynı prosedür bir ay sonra tekrarlanır ve vaskülatür aynı bölgeyi tekrar bulmak için bir dönüm noktası olarak kullanılır. Lgr5-eGFP konfeti modelini kullanarak, kurtarma dinamiklerini haritalamak için farklı renklerle etiketlenmiş kriptler zaman içinde takip edilebilir. Bu örnekte, yeşil renkli kriptler Lgr5 Cre'yi ifade etmektedir ve macenta içindeki bir kript konfeti rengiyle etiketlenmiştir.
Lazer ablasyondan iki hafta sonra farklı rejenerasyon modları gözlenir. Bazı bölgeler değişmeden kalırken, diğer bölgeler kript fisyonu formlarında yeniden yapılanma sergiler, bu nedenle bir kriptin ikiye bölünmesi veya füzyon, iki kriptonun bir araya getirilmesi veya kriptonun kaybolması. İntravital mikroskopi yöntemi ile kombine lazer ablasyon, hasarı tanımlanmış bir ilgi alanına sınırlar.
Bu, hasarın yerini ve hasar boyutunu kontrol etmemizi sağlar. Hasar şiddeti, kriptoları veya tüm bağırsak alanlarını ablate etmek için modüle edilebilir ve bizi kript ölçeğindeki rejeneratif yanıt hakkında bilgilendirir. Uzamsal kontrole ek olarak, lazer ablasyon aynı zamanda aynı organı aynı farede hem homeostatik hem de yenileyici koşullar altında görüntülemenin yanı sıra hasarın başlangıcını hassas bir şekilde zamanlamaya izin verir, böylece önceki yaralanma modellerinin hassasiyetini aşar.
Lazer ablasyon ve tekrarlayan intravital görüntüleme uygulaması, çok sayıda araştırma sorusu ve rejenerasyon, immünoloji ve kanser araştırmalarını kapsayan çeşitli bilimsel alanlar için bir platform olarak kullanılabilir.
