Модели травм необходимы для изучения регенерации in vivo, однако доказано, что исследование регенерации в кишечнике является технической задачей. Отсутствие протоколов продольной визуализации помешало более глубокому пониманию динамики клеточного и тканевого масштаба, которая организует регенерацию кишечника. В этом протоколе мы описываем метод прижизненной микроскопии, который локально индуцирует повреждение тканей в масштабе одной крипты и следует за регенеративной реакцией кишечного эпителия у живой мыши на фотонное лазерное абляционное повреждение одиночных крипт или более крупных кишечных полей контролируемым временем и пространством.
Последующая, долгосрочная, повторяющаяся прижизненная визуализация позволяет отслеживать поврежденный участок с течением времени и позволяет контролировать динамику крипт во время восстановления тканей в течение нескольких недель. Индуцируйте мышей, вводя тамоксифен, растворенный в подсолнечном масле, за четыре-шесть недель до операции. Наложите анальгезию, введите 200 микролитров бупренорфина подкожно за 30 минут до операции.
Вводите карпрофен в питьевую воду за 24 часа до операции. Внедрите автоклавные стерильные хирургические инструменты в шкаф биологической опасности. Включите грелку и установите температуру 37 градусов по Цельсию.
Включите камеру контроля температуры микроскопа не менее чем за четыре часа до получения изображения. Поддерживайте стабильную температуру внутри климатической камеры на уровне 37 градусов по Цельсию. Включите двухфотонный микроскоп, сканер и лазер.
Запустите программное обеспечение для обработки изображений. Настройте длину волны лазера на 960 нанометров и откройте затвор. Обезболите мышь, используя от двух до 3% изофлурана, и поместите ее на грелку, покрытую стерильной тканью.
Проверьте глубину анестезии, оценив частоту и качество дыхания один вдох в секунду, а также проверив рефлекс мыши. Покройте глаза мыши глазной мазью. Введите 200 микролитров предварительно подогретого стерильного физиологического раствора подкожно.
Побрейте живот и удалите волосы. Поменяйте стерильную ткань в хирургической области. Вставьте ректальный зонд, чтобы контролировать температуру мыши.
Температура должна быть примерно на уровне 37 градусов тепла. Наденьте новую пару стерильных перчаток. Очистите операционную область круговым путем, чередуя скрабы с антисептическим раствором, а затем трижды втирая 80% этанол.
Накройте мышь стерильной хирургической простыней. Проверьте рефлекс мыши. Сделайте 10-миллиметровый вертикальный разрез по средней линии кожи с помощью стерильного скальпеля.
Надрежьте белую линию ножницами, чтобы отделить прямые мышцы живота и открыть живот. Найдите слепую кишку мыши с помощью стерильного ватного тампона, смоченного в предварительно подогретом физиологическом растворе, чтобы использовать его в качестве ориентира. Сделайте небольшой надрез в кусочке марли, смочите его в предварительно разогретом стерильном физиологическом растворе и поместите над разрезом.
Извлеките кишечник стерильными ватными тампонами, смоченными в предварительно подогретом стерильном физиологическом растворе. Поддерживайте гидратацию кишечника, добавляя стерилизованный предварительно подогретый физиологический раствор. Перенесите мышь в предварительно нагретую стерильную коробку для визуализации.
Поместите кишечник на стерильное стекло. Поместите голову мыши внутрь ингаляционной трубки коробки для визуализации. При необходимости закрепите мышь стерильной гибкой пленкой и скотчем.
Поместите коробку для визуализации с мышью в камеру микроскопа. Контролируйте мышь во время визуализации, проверяя частоту и глубину дыхания, а также температуру с помощью ректального зонда каждые 15 минут. Изофлуран следует держать от одного до 2% в кишечнике с помощью IP-адресов микроскопа.
Получите широкое поле зрения интересующей области с помощью внутренней камеры микроскопа. Изображение интересующей области с помощью 960-нанометрового лазера многофотонного микроскопа. Отрегулируйте мощность лазера и длину волны в соответствии с флюороформами, используемыми в эксперименте.
В этом примере крипты, экспрессируемые мембраной, представляют собой красный флуоресцентный белок и стохастически мечены зеленым флуоресцентным белком при индукции низкой конечной дозой тамоксифена. Приобретите Z-стек с шагом от 10 до 20 трех микрон интересующей области. Выберите одну или несколько позиций на изображении плитки.
Используйте функцию калибровки точки разрыва в программном обеспечении для обработки изображений при увеличении 32 и разрешении 124 на 124 пикселя со скоростью сканирования 400 Гц, используя свойство двунаправленного сканирования в течение трех-10 секунд, в зависимости от размера предполагаемого повреждения. Инициацию повреждения в области крипты можно распознать по увеличению автофлуоресценции как в зеленом, так и в красном канале. После абляции приобретите Z-стеки поврежденных областей, чтобы подтвердить местоположение и степень повреждения.
Повторите предыдущие два шага для нескольких областей в одной мыши. Поместите мышь, еще находясь под наркозом, на стерильную область наложения швов и накройте стерильной простыней. Вставьте открытую кишку обратно в брюшную полость с помощью стерильных ватных тампонов, смоченных в предварительно нагретом стерильном физиологическом растворе.
Сшить белую линию, выполнив простой непрерывный шов с использованием рассасывающегося шва. Закройте конечности шва хирургическими узлами. Повторите тот же шаг со слоем кожи.
Выключите изофлурановую станцию, очистите и стерилизуйте коробку визуализации и вкладыш. Дайте мышке восстановиться после операции, пока клетка помещается на грелку на один час. Введите 200 микролитров бупренорфина подкожно через шесть-12 часов после операции.
Вводите карпрофен в питьевую воду в течение 72 часов после операции. Взвешивайте мышь и следите за самочувствием каждый день в течение одной недели после операции. Во второй момент времени, по крайней мере, через неделю после первого сеанса визуализации, повторите операцию и прижизненную визуализацию.
Используйте узор кровеносных сосудов, чтобы найти те же области интереса изображения в первый момент времени. Если мышь не предназначена для съемки в другой момент времени, пожертвуйте мышью, выполнив вывих шейки матки под наркозом. В противном случае продолжайте закрывать место операции и послеоперационный уход.
Мышам K19-Cre ERT mTmG вводили тамоксифен, чтобы индуцировать стохастическую маркировку клеток GFP за четыре-шесть недель до операции и первого сеанса визуализации. После хирургического облучения кишечника мыши и получения камерных и флуоресцентных изображений интересующей области настройки точки нарушения многофотонного лазера используются для удаления крипт. Начало повреждения можно распознать по увеличению автофлуоресценции как в зеленом, так и в красном канале.
Та же процедура повторяется через месяц, и сосудистая сеть используется в качестве ориентира, чтобы найти ту же область. Используя модель конфетти Lgr5-eGFP, можно отслеживать крипты, помеченные разными цветами, с течением времени, чтобы отобразить динамику восстановления. В этом примере склепы зеленого цвета выражают Lgr5 Cre, а крипта пурпурного цвета помечена цветом конфетти.
Через две недели после лазерной абляции наблюдаются разные режимы регенерации. Некоторые регионы остаются неизменными, в то время как другие регионы демонстрируют ремоделирование в формах деления крипты, поэтому разделение одного склепа на два, или слияние, слияние двух склепов в один, или исчезновение крипты. Лазерная абляция в сочетании с методом прижизненной микроскопии ограничивает повреждение определенной интересующей области.
Это позволяет нам контролировать местоположение повреждения, а также степень повреждения. Тяжесть повреждения может быть модулирована для удаления крипт или целых кишечных полей, чтобы сообщить нам о регенеративном ответе в масштабе крипты. В дополнение к пространственному контролю, лазерная абляция также позволяет точно определить время начала повреждения, а также визуализировать один и тот же орган как в гомеостатических, так и в регенерирующих условиях у одной и той же мыши, тем самым превосходя точность предыдущих моделей травм.
Применение лазерной абляции и повторяющейся прижизненной визуализации может быть использовано в качестве платформы для множества исследовательских вопросов и различных научных областей, которые охватывают регенерацию, иммунологию и исследования рака.
