Este protocolo describe la fabricación de barras de micro gel que se entrelazan en andamios de microporos. Estos andamios se pueden utilizar en combinación con células que proporcionan el espacio necesario para una interacción celular eficiente. Los dos tipos diferentes de barras de micro gel se entrelazan al contacto.
En la alta relación de aspecto conduce a poros más grandes mientras se mantiene la estabilidad del andamio utilizando menos material sintético en comparación con los microgeles esféricos. Los andamios de microporos mejorarían significativamente la infiltración y la interacción de las células endógenas para reparar el tejido dañado. Los poros grandes facilitarán la formación de vasos sanguíneos para intercambiar nutrientes al tejido en crecimiento.
La reducción del material de andamiaje es beneficiosa ya que se proporcionan más espacios abiertos para la formación de tejidos, lo cual es importante tanto para aplicaciones in vitro como in vivo. Un aspecto crítico es la técnica microfítica sobre quipulación. Para garantizar la producción continua de barras de microgel, el producto debe transportarse eficazmente fuera del tubo sin obstruirse.
Para comenzar, inserte las agujas en los tubos de polietileno y retire el gas de la jeringa y del tubo. Luego inserte un tubo de polietileno adicional en la salida para la recolección del producto. A continuación, coloque todas las jeringas de vidrio y las bombas de jeringa e inserte cada extremo del tubo en la entrada correspondiente.
Luego, enfoque el microscopio en la sección transversal de aceite y agua. Encienda la primera bomba de jeringa de aceite para llenar el canal con aceite primero, para evitar la humectación del canal por la fase dispersa. Luego, disminuya el primer caudal de aceite a 30 microlitros por hora y arranque la bomba de jeringa de prepolímero hasta que se pueda observar la fase acuosa dispersa en la sección transversal.
A continuación, ajuste el caudal del prepolímero a 30 microlitros por hora y enfoque el microscopio en la salida. Luego, encienda la segunda bomba de jeringa de aceite y espere hasta que el régimen de flujo sea estable. Coloque el tubo de salida en un recipiente de recolección y ajuste el sistema de irradiación UV de tal manera que la irradiancia esté en el rango de 900 a 1000 milivatios por centímetro cuadrado.
Y el punto de irradiación es la parte del canal recto antes de la salida. Antes de la irradiación UV, ajuste los caudales del prepolímero y del primer aceite para lograr la relación de aspecto deseada en el rango de 3.0 a 4.5, y establezca el tiempo de irradiación de la fase dispersa en aproximadamente 2.3 segundos, dependiendo del tamaño del punto de irradiación. Luego comience la irradiación UV y, si es necesario, ajuste los caudales nuevamente de acuerdo con la subsección anterior.
A continuación, cambie el contenedor de recolección y anote la hora de inicio de la recolección del producto y los caudales. Para finalizar la recolección, quite el contenedor de recolección anotando la hora. Después, detenga la irradiación y todas las bombas de jeringa.
Posteriormente, lave el producto cinco veces cada una con n-hexano, isopropanol y agua desionizada. Luego retire el sobrenadante después de la sedimentación de la varilla. Transfiera la dispersión del primer componente a un vial transparente cónico de 1,5 o dos mililitros.
A continuación, añadir el segundo componente de forma controlada en un funcionamiento continuo con una pipeta de 100 microlitros y mezclar el contenido directamente con la pipeta para tomar líquido y añadirlo de nuevo. Luego agregue la solución G R G D S P C a la estructura interconectada para modificar todos los grupos epoxi restantes con el péptido adhesivo celular que lleva una amina libre y thyal y déjelo a temperatura ambiente durante la noche. A continuación, retire las moléculas no reaccionadas lavándolas con agua desionizada y retire el sobrenadante.
Después de reducir el nivel de agua, abra el vial y desirradie con luz UV de longitud de onda, de 250 a 300 nanómetros. A continuación, cierre el vial y transfiera el vial a un banco limpio. Después, lavar con agua estéril.
Reemplace el agua del vial con medios de cultivo celular y permita el equilibrio durante cinco minutos. A continuación, transfiera el andamio macroporoso a una placa de pozo de cultivo celular para el experimento vertiendo o usando una espátula. La microscopía confocal reveló que la construcción macroporosa 3D estaba compuesta de barras de microgel funcionalizadas con amina y epoxi interconectadas.
La construcción exhibe una geometría compacta de aproximadamente 10, 000 micro barras de gel formadas en dos o tres segundos. El módulo efectivo de Young de varillas de micro gel de amina y epoxi junto con esferas de micro gel de amina y epoxi se mide mediante nano indentación. Para detectar grupos funcionales activos, el isotiocianato de fluoresceína se puede usar para visualizar grupos amino primarios y el isómero de fluoresceína amina uno se puede emplear para etiquetar grupos epoxi.
Las varillas de micro gel de amina tienen dimensiones con una longitud promedio de 553 micrómetros y un ancho promedio de 193 micrómetros en agua desionizada, lo que resulta en una relación de aspecto de aproximadamente 3.0. Los valores medios de los macroporos y los andamios compuestos por micro varillas de gel son de 100 micrómetros, con un 90% de los tamaños de poro que van desde 30 micrómetros hasta más de 150 micrómetros. La esfera como micro geles, dan como resultado grupos con tamaños de poro entre aproximadamente 10 a 55 micrómetros, con un valor medio de alrededor de 22 micrómetros.
Las barras de microgel descritas están diseñadas para producir andamios de microporos interconectados mediante mezcla aleatoria. Un procedimiento de mezcla controlado podría permitir la fabricación de geometrías de andamio más personalizadas en el futuro. La rigidez de los microgeles y las señales bioquímicas se pueden variar en función de los requisitos de venta.
Al combinar diferentes bloques de construcción, se puede lograr una amplia variedad de geometrías y propiedades dentro de un andamio. De esta manera podemos apuntar a células específicas de manera eficiente para formar tejidos multicelulares.
