Este protocolo presenta el Sistema de Activación SPH CRISPR como una estrategia alternativa a los vectores virales convencionales para realizar ensayos de función de ganancia en adipocitos. Permite la sobreexpresión de genes endógenos de adipocitos únicos o múltiples dentro del complejo entorno celular del tejido adiposo mediante la entrega de un ARN guía único personalizado utilizando un virus adenoasociado. Los pasos desafiantes de este protocolo están relacionados con la clonación del ARN guía único y la producción e inyección de virus adenoasociados en el tejido adiposo.
Para comenzar, diseñe ARN guía única o ARNg para la activación de CRISPR utilizando chopchop o cualquier otra herramienta adecuada. Diseñar el sgRNA dirigido al gen PRDM16 utilizando los siguientes parámetros:Target como PRDM16 en un musculus musculoso usando un CRISPR/Cas9 y para como activación. Agregue voladizos al sgRNA para que coincida con el sitio de restricción Sac1 en la columna vertebral vectorial PAAVU6GRNACBHM cereza.
Incluye 5'AGCT 3' donde n corresponde a nucleótidos. Obtener la secuencia inversa del complemento 3'sgRNA utilizando la herramienta indicada. A continuación, para el recocido de oligonucleótidos complementarios monocatenarios, agregue un microlitro de cada oligonucleótido monocatenario de 5' y 3', un microlitro de tampón ligasa T4, 0.5 microlitros de polinucleótido quinasa T4 y 6.5 microlitros de agua para un volumen de reacción final de 10 microlitros.
Analice los oligonucleótidos monocatenarios complementarios usando un termociclador a 37 grados centígrados durante 30 minutos y 95 grados centígrados durante cinco minutos, seguido de una tasa de reducción de cinco grados centígrados por minuto. Luego, para la ligadura de oligonucleótidos de ARNg recocidos, agregue 25 nanogramos de cereza PAAVU6GRNACBHM plásmido a dos microlitros de oligonucleótidos sgRNA recocidos, un microlitro de enzima Sac1, dos microlitros de tampón de ligasa de ADN T4 10X, un microlitro de ligasa de ADN T4 y agua a un volumen de reacción final de 10 microlitros. Usando un termociclador, realice la ligadura incubando la mezcla de reacción durante 15 ciclos a 37 grados centígrados durante cinco minutos y 25 grados centígrados durante cinco minutos, seguido de una retención a cuatro grados centígrados.
A continuación, transforme las células competentes de Escherichia coli DH10B con cuatro microlitros del producto de ligadura mediante choque térmico a 42 grados centígrados durante 45 segundos y extiéndalas sobre una placa de agar que contiene 10 microgramos por mililitro de ampicilina. Confirme las colonias transformadas por reacción en cadena de la polimerasa de colonias o PCR utilizando la mezcla maestra de PCR, elija la colonia y mézclela con cinco microlitros de mezcla maestra, 0.1 microlitros de cebador universal, 0.1 microlitros de cebador inverso sgRNA y cinco microlitros de agua. Ejecute la PCR utilizando la desnaturalización inicial a 94 grados centígrados durante dos minutos, seguida de 35 ciclos de desnaturalización a 94 grados centígrados durante 20 segundos, recocido durante 30 segundos a 60 grados centígrados, extensión a 72 grados centígrados durante 30 segundos y un paso final de alargamiento a 72 grados centígrados durante cinco minutos.
Después de la PCR, resuelva el ADN usando electroforesis en gel de agarosa en tampón TAE 0.5X a 90 voltios durante 30 minutos. Envíe muestras positivas para la secuenciación de Sanger utilizando imprimación universal. A continuación, purifica el plásmido de un clon positivo usando un kit de purificación de plásmidos siguiendo las instrucciones del fabricante.
Coloque el ratón anestesiado en posición supina y afeite un área pequeña en los flancos proximales a las articulaciones de la cadera para el tejido adiposo blanco inguinal o inyecciones IWAT con una afeitadora. Añadir crema depilatoria durante cinco minutos. Retire la crema residual con agua para evitar quemaduras en la piel.
Desinfecte la piel usando tres rondas alternas de aplicación de la solución de povidona yodada sobre la piel con gasa limpia y alcohol al 70%. Luego, haga una incisión de uno o dos centímetros con tijeras esterilizadas en el área proximal de las articulaciones y mantenga la piel abierta con fórceps para exponer el depósito de grasa. El WAT se puede unir a la piel en ambos lados extendiéndola desde el principio desde la espalda y hacia los testículos.
Con fórceps, tire suavemente del depósito de grasa hacia arriba a través de la incisión para asegurarse de que la inyección esté en la ubicación y profundidad correctas. Llene la jeringa de microlitros con 2,5 microlitros del virus adenoasociado o un AAV que contenga el sgRNA dirigido al gen PRDM16 endógeno. Inserte cuidadosamente la aguja en un ángulo de 30-45 grados en el IWAT.
Repita la inyección cinco veces en diferentes ubicaciones del tejido para infectar homogéneamente toda la almohadilla de grasa IWAT. Coloque el ratón sobre la almohadilla térmica hasta que recupere la conciencia. Monitoree al animal cada 10 a 15 minutos hasta que se recupere por completo.
Después de que el animal recupere la conciencia, observe el perfil de la locomotora, que debe ser lineal y no tener signos de angustia o dolor. Vea las células vasculares estromales o SVF derivadas de adipo SPH ratón IWAT en una placa de 6 pocillos que contiene medio DMEM completo durante una o dos horas, aspire el medio, lave el pocillo dos veces usando PBS y reemplácelo con un medio fresco y completo. Incubar las células a 37 grados centígrados, 5% de dióxido de carbono y 95% de humedad hasta que las células alcancen 70-80% de confluencia.
En el día 0, inducir la diferenciación tratando las células con el medio de inducción y después de dos días reemplazar el medio de inducción con el medio de mantenimiento. Nuevamente después de dos días, en el cuarto día, reemplace el medio de mantenimiento con un medio de mantenimiento nuevo durante 2-3 días. Cambiar el medio de mantenimiento cada 48 horas hasta que los preadipocitos estén completamente diferenciados en adipocitos.
Observe los adipocitos maduros usando microscopía óptica ya que las células diferenciadas parecen estar cargadas de gotas de lípidos. Después de cultivar las células en una placa de cultivo de 6 pocillos con el medio completo hasta que las células alcancen el 70-80% de confluencia, mezcle 5.6 * 10 ^ 10 genoma viral por microlitro de ARNg portador de AAV PRDM16 con dos mililitros de medio completo y bromuro de hexadimetrina. Transducir las células reemplazando el medio completo y agregando el medio completo que contiene AAV.
Incubar las células transducidas durante 12 horas a 37 grados centígrados, 95% de humedad y 5% de dióxido de carbono. Divida y vea las células como se describe para la proliferación celular y la diferenciación en adipocitos beige. Las imágenes de inmunofluorescencia de IWAT de ratones adipo SPH demostraron la expresión de dCas9 tanto en el grupo control como en el PRDM16.
La expresión de PRDM16 inducida por SPH indujo claramente una acumulación generalizada de adipocitos beige multioculares en IWAT. Además, la PCR cuantitativa reveló una mayor expresión de PRDM16 y el programa de genes termogénicos en el grupo PRDM16 en comparación con el control. Del mismo modo, el análisis de expresión génica in vitro confirmó el aumento de la expresión del gen PRDM16 endógeno y los genes termogénicos en el grupo de sobreexpresión PRDM16 en comparación con el control.
La expresión de PRDM16 inducida por SPH resultó en un mayor consumo de oxígeno basal y máximo que en las células de control. Es importante destacar que los datos indicaron una mejor respiración desacoplada en el grupo PRDM16 en comparación con el grupo de control. El modelo Adipo SPH es adecuado para investigar múltiples genes y elementos reguladores dentro de los adipocitos.
Este método abre la posibilidad de una comprensión más profunda de la biología de la grasa beige.
