Este protocolo se utiliza para estudiar cuantitativamente el ensamblaje y la estructura de los segmentos iniciales de axones de las neuronas del hipocampo que carecen de AIS preensamblado debido a la ausencia de una anquilona-G gigante. Para empezar, diseccione de seis a ocho hipocampos de postnatal, cachorros de un día de edad con medio HBSS en una placa de Petri. Picar los hipocampos con tijeras de disección en trozos más pequeños, y transferirlos desde el plato a un tubo de 15 mililitros.
Lave el hipocampo dos veces con cinco mililitros de HBSS y déjelos en 4.5 mililitros de HBSS después del lavado. Agregue 0.5 mililitros de tripsina al 2.5% en 4.5 mililitros de HBSS e incube en un baño de agua de 37 grados Celsius durante 15 minutos, invirtiendo el tubo cada cinco minutos. Los hipocampos bien digeridos deben volverse pegajosos y formar un grupo.
Si es necesario, extienda la digestión durante cinco minutos más. Lave los hipocampos con HBSS tres veces durante cinco minutos por lavado. Después del lavado, añadir dos mililitros de HBSS y pipetear el hipocampo hacia arriba y hacia abajo con una pipeta Pasteur 15 veces.
Triturar el tejido con una pipeta Pasteur pulida al fuego 10 veces, y descansar el tubo durante cinco minutos hasta que todos los trozos se establecen en el fondo. Repita la trituración con los trozos restantes hasta que la mayoría de ellos hayan desaparecido. Luego, use una punta de pipeta de un mililitro para transferir suavemente el sobrenadante que contiene las neuronas disociadas a los platos de chapado.
Añadirlo directamente al medio de chapado preincubado y agitar la placa suavemente. Dos a cuatro horas después de la siembra, revise los platos de chapado con un microscopio de luz. La mayoría de las neuronas deben haber unido a la resbalón de la cubierta.
Usando un fórceps de punta fina, voltee los resbalones de la cubierta a los platos del alimentador de células gliales que contienen un medio de cultivo neuronal precondicionado con los puntos de cera hacia el lado hacia abajo. Las neuronas pueden crecer en los platos de alimentación de células gliales hasta por un mes. Alimentar a las neuronas cada siete días con un mililitro de medio de cultivo neuronal fresco.
En el tercer día in vitro, voltear la cubierta se desliza con el lado del punto de cera hacia arriba en un plato alimentador de células gliales con medio de cultivo neuronal acondicionado. Mezcle 0,25 microgramos de ADN CRE BFP con 0,5 microgramos de ADN ankyrin-G GFP en un tubo de 1,7 mililitros para transfectar cuatro resbalones de cubierta. Añadir 100 microlitros óptimos.
A continuación, mezclar el tubo y descansado en un bastidor. Si sólo se transfecta cre BFP, la columna vertebral plásmica GFP se utiliza para que coincida con la cantidad total de ADN. Mezcle tres microlitros de reactivo de transfección con 100 microlitros de óptimo en un nuevo tubo de 1,7 mililitros e incube el tubo durante cinco minutos a temperatura ambiente.
Luego, mezcle 100 microlitros del ADN previamente mezclado con 100 microlitros de mezcla de reactivos de transfección y déjelo durante cinco a 10 minutos en un estante. Agregue 50 microlitros de la mezcla de ADN en la parte superior de cada resbalón de la cubierta insertando la punta justo debajo del medio sin tocar los resbalones de la cubierta. Pipetee lentamente para evitar la propagación de la mezcla de ADN.
Lleve lentamente el plato de vuelta a la incubadora y déjelo allí durante 30 a 45 minutos. Voltear la cubierta se desliza de nuevo al plato de alimentación glial de casa con el lado del punto de cera hacia abajo y poner el plato de nuevo en la incubadora. Para la cuantificación de AIS, abra las imágenes de la serie Z en Fiji y genere una proyección máxima de imágenes.
Después de restar la señal de fondo de deslizamiento de la cubierta vacía de la imagen, dibuje una línea a lo largo del AIS, asegurándose de que el ancho de la línea cubra completamente el AIS. Comience la línea antes de que la señal AIS se eleve sobre el fondo y pare después de que caiga al fondo. Mida la intensidad media de píxeles a lo largo de la línea y expórtela a una hoja de cálculo.
A continuación, ejecute un script MATLAB para generar la figura final. El experimento debe incluir cre-BFP sólo transfección como control negativo, Cre-BFP más 480 kilodalton ankyrin-G cotransfection como control positivo, y una condición no transfectada como control de la técnica. En el control de Cre-BFP solamente, las neuronas transfectadas carecen de la acumulación de marcadores de AIS, incluyendo ankyrin-G, beta 4 spectrin, neurofascin, y canales de sodio bloqueados voltaje.
En contraste, Cre y 480 kilodalton ankyrin-G co-transfected neuronas han montado completamente AIS, que se demuestra por la presencia de marcadores AIS. Es importante confirmar la calidad del cultivo a través de la comparación con los platos no transfectados. Las neuronas no saludables tienden a mostrar una estructura anormal de AIS, como AIS descontinuado o ectópico.
Para evaluar cómo una mutación humana del desorden del neurodevelopmental del ankyrin-G afecta a la asamblea del AIS, la intensidad media del AIS fue trazada del soma al axón distal. Las proteínas enriquecidas con AIS normalmente muestran un rápido aumento de la señal del axón proximal y una disminución lenta de la señal al axón distal. Cuando se alinea con el AIS no transfectado, la curva mutante es más ancha y el pico de la curva es menor, lo que sugiere un cambio de estructura de AIS.
El tipo salvaje ankyrin-G ensambló AIS alineado estrechamente con el no transfectado.
