Los cultivos de tubuloides renales se pueden establecer a partir de tejido renal sano y de orina, lo que permite la generación de modelos representativos para estudiar la enfermedad renal y la fisiología. Este protocolo permite la generación de tubuloides renales sanos a partir de tejidos y orina, siendo esta última una forma no invasiva y amigable para el paciente de obtener material para la generación de cultivos. Los cultivos tubuloides se pueden utilizar para estudiar la fisiología renal y para el modelado de enfermedades, como enfermedades renales infecciosas, malignas y hereditarias.
Para generar tubuloides renales humanos a partir de tejido, coloque la muestra de tejido renal en un mililitro de DMEM avanzado más más más medio en una placa de Petri de 10 centímetros y use bisturíes para picar el tejido en pedazos de aproximadamente un milímetro cúbico de tamaño. Use bórceps y bisturíes para transferir las piezas de tejido a un tubo de 15 mililitros y lave el plato con cinco mililitros de medio fresco. Use una pipeta estéril de 10 mililitros para transferir el medio al tubo.
Sedimentar las piezas de tejido por centrifugación y resuspend el pellet en tres a cuatro mililitros de solución de colagenasa. Incubar los tejidos en un agitador horizontal a 37 grados centígrados y 250 revoluciones por minuto durante 45 a 60 minutos con agitación vigorosa cada 15 minutos. Cuando la suspensión sea homogénea y la mayoría de las piezas de tejido se hayan digerido, llene el tubo con medio y mezcle de cinco a 10 veces por inversión.
Centrifugar la suspensión. Si el gránulo es rojo, agregue un mililitro de tampón de lisis de glóbulos rojos al tubo durante una incubación de cinco minutos a temperatura ambiente. Al final de la incubación, lave el tubo con medio fresco.
Si los trozos de tejido aún son visibles, vuelva a colocar el pellet con cinco mililitros de medio fresco y filtre la suspensión a través de un colador de células de 100 micras en un tubo de 50 mililitros. Transfiera la suspensión filtrada a un nuevo tubo de 15 mililitros para centrifugación y use una pipeta P1000 configurada a un volumen conocido para medir el volumen del pellet de celda. Resuspónda cuidadosamente el pellet sin crear burbujas de aire e incube las células durante un minuto en hielo.
Al final de la incubación, vuelva a colocar el pellet en un volumen de 70 a 75% de extracto de membrana basal y placa 15 gotas de microlitro de la suspensión resultante en una placa de cultivo celular multiburo calentada de 37 grados. Cuando todas las gotas hayan sido chapadas, incube la placa boca abajo a 37 grados Celsius durante 15 a 20 minutos, luego agregue el volumen apropiado de medio de cultivo calentado de 37 grados Celsius e inspeccione los cultivos bajo un microscopio de campo brillante. Para generar tubuloides renales humanos a partir de la orina, divida la muestra de orina por igual entre tubos de 50 mililitros y lave las muestras dos veces con 10 a 20 mililitros de medio de lavado fresco por lavado.
Después del segundo lavado, vuelva a colocar los gránulos en sus sobrenadantes residuales y aglutine las muestras en un solo tubo de 15 mililitros para una tercera centrifugación. Mida el volumen de la gránulo celular como se ha demostrado y resuspante cuidadosamente el gránulo sin crear burbujas de aire. Después de un minuto de incubación en hielo, vuelva a colocar el pellet en un volumen de 70 a 75% de extracto de membrana basal y placa 15 gotas de microlitros de la suspensión resultante en placas de cultivo de múltiples podos calentadas a 37 grados Celsius como se ha demostrado, luego incube las gotas boca abajo durante 15 a 20 minutos antes de agregar medio fresco y ver los cultivos por microscopía de luz.
Después de una o dos semanas de cualquier tipo de cultivo, use una pipeta P1000 para interrumpir las gotas tubuloides en cada pozo usando la punta para raspar los fondos de los pozos para recolectar las células adjuntas. Extraiga el contenido del pozo en un solo tubo de 15 mililitros que contenga 10 mililitros de medio avanzado DMEM plus plus plus y recoja los tubuloides por centrifugación. Según el tamaño del pellet, agregue el agente de reemplazo de tripsina suplementado con 10 micromolares Y27632 para una incubación de cinco minutos a 37 grados centígrados.
Al final de la incubación, use una punta de pipeta de 1, 000 microlitros con una punta de pipeta de 10 microlitros colocada sobre la punta para pipetear la suspensión tubuloide de 20 a 30 veces. Verifique bajo el microscopio para ver si todavía hay tubuloides intactos dentro del tubo. Menos del 10% de los tubuloides intactos están presentes, llena el tubo con DMEM avanzado fresco plus plus plus y recoge los tubuloides por centrifugación para permitir que el volumen de pellets se mida como se ha demostrado.
Resuspenda el pellet en un volumen de 70 a 75% de extracto de membrana basal y placa de 15 gotas de microlitros en una placa de cultivo celular multiburo calentada de 37 grados Celsius. Después de una incubación invertida de 15 a 20 minutos a 37 grados centígrados, agregue un medio de cultivo precalentado a las gotas e inspeccione el cultivo mediante microscopía de luz. Los tubuloides generados a partir de muestras de tejido renal generalmente aparecen dentro de los siete días posteriores al establecimiento del cultivo y deben pasarse dentro de una o dos semanas posteriores al recubrimiento.
En los cultivos de orina, las estructuras tubuloides compactas y las células adherentes aparecen aproximadamente de 14 a 21 días después del recubrimiento y el primer paso generalmente ocurre entre tres y cuatro semanas. La presencia de tubuloides epiteliales quísticos aumenta con cada pasaje. La generación exitosa de cultivos tubuloides renales humanos se puede evaluar mediante tinción inmunohistoquímica para marcadores expresados en el epitelio renal tubular, como la proteína pareada del gen 8 de la caja.
Un momento correcto de la digestión enzimática del material tisular y el procesamiento rápido de las muestras de orina son pasos cruciales para el resultado exitoso de estos protocolos. La alta eficiencia del establecimiento de cultivos de tubuloides renales puede allanar el camino para las pruebas específicas del paciente de nefrotoxicidad inducida por medicamentos, un efecto secundario común de muchos quimioterapéuticos.
