La señalización Notch controla la decisión y el patrón de sulfato durante el desarrollo en metazoos. Hemos desarrollado un ensayo de captación de anticuerpos para etiquetar el ligando delta-D y obtener imágenes de su tráfico endocítico en progenitores de glía radial en el cerebro anterior del pez cebra en desarrollo. La inyección ventricular cerebral oculta del pez cebra permite la captación selectiva de Anti-Dld-Atto-647N por progenitores de glía radial miotósica que recubren los ventrículos cerebrales en desarrollo con alta eficiencia y efectos duraderos.
Este protocolo puede combinarse fácilmente con otras perturbaciones farmacológicas o genéticas utilizadas en diferentes etapas del desarrollo y posiblemente adaptadas al cerebro adulto, así como a organoides cerebrales 2D o 3D derivados de células madre pluripotentes humanas. Después de generar los embriones fertilizados e incubarlos durante 18 a 20 horas, retírelos de la incubadora. Obsérvelos bajo un microscopio de epifluorescencia usando luz blanca primero con un aumento de 20 veces.
Deseche los embriones muertos que parezcan turbios o rotos bajo el microscopio usando una pipeta de vidrio. Luego encienda la lámpara fluorescente y elija la configuración del filtro RFP del microscopio. Seleccione los embriones con fluorescencia roja fuerte y transfiéralos a un nuevo plato con agua de huevo.
Ahora decorionar los embriones manualmente con dos pinzas finas bajo luz blanca. Sostenga el corion con un par de fórceps y haga un desgarro en el corion con los otros fórceps. Abra el desgarro con cuidado usando los fórceps y hágalo lo suficientemente grande para que el embrión pase empujando suavemente el embrión con las puntas de los otros fórceps.
Transfiera los embriones descorionados a una nueva placa de Petri con medio embrionario fresco para un enjuague rápido antes de la microinyección. Después de tirar de agujas finas de inyección en un extractor, abra la punta de la aguja con fórceps bajo un microscopio de disección estéreo. Haga que el diámetro de la punta sea de alrededor de 10 micrómetros y el ángulo cónico de alrededor de 30 grados.
Ahora mezcle 0.5 microlitros del anticuerpo anti-Dld con dos microlitros del anticuerpo anti ratón L G Atto-647N pipeteando de cinco a 10 veces para conjugarlos e incubar a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos. Al final de la incubación, agregue 2.5 microlitros de tampón de bloqueo y 0.5 microlitros de rojo fenol al 0.5% a la mezcla de anticuerpos y mezcle por pipeteo para bloquear cualquier anticuerpo no conjugado que quede en la mezcla. A continuación, prepare una agarosa de bajo punto de fusión al 1% en el medio embrionario.
Caliente la mezcla contenida en agarosa a 70 grados centígrados hasta que la mezcla se vuelva transparente. Después de alícuota la solución de agarosa, manténgalos en un bloque de calor a 40 grados centígrados. Enjuague el embrión en el tubo que contiene 1% de agarosa de bajo punto de fusión durante tres segundos.
Coloque el embrión en una tapa de placa de Petri de plástico invertida con gotas de agarosa individuales para montar cada embrión por separado. Coloque los embriones planos lateralmente en la agarosa y mantenga esta posición hasta que la agarosa se haya solidificado a temperatura ambiente. Cubra todos los embriones montados en la agarosa con medio de huevo.
Coloque los embriones incrustados bajo el microscopio estereoscópico y cubra la agarosa con agua de huevo. Coloque el inyector de presión de aire con micromanipuladores, colocándolos cerca de los microscopios. Utilice el cilindro de gas de acero que contiene nitrógeno gaseoso a alta presión como recurso de aire.
Una vez que los embriones hayan sido montados en la agarosa, abra la válvula de gas. Mientras usa el módulo de llenado frontal del microinyector, cargue frontalmente la aguja de vidrio preparada con dos microlitros de mezcla de anticuerpos en el micromanipulador. Ahora ajuste la presión de entrada a 80 a 90 libras por pulgada cuadrada y la presión de inyección a 20 libras por pulgada cuadrada.
Calibre el volumen de inyección usando un micrómetro bajo el microscopio. Ajuste la duración del tiempo de sintonía de acuerdo con el tamaño de la abertura de la aguja de 10 a 120 milisegundos. Toque la paleta para administrar cada pulso de inyección y ajuste el volumen de inyección de cada entrega a cuatro o cinco nanolitros.
Luego empuje la punta de la aguja de microinyección a través de la placa dorsal del techo del cerebro posterior, posterior al punto de bisagra rondimere cero-uno e inyecte aproximadamente 10 nanolitros de mezcla de anticuerpos sin golpear el tejido cerebral. Se observó el flujo de fluidos rojos en el ventrículo cerebral. Después de la inyección, retire la punta de la aguja del embrión rápidamente girando la perilla del micromanipulador.
Para una inyección exitosa, el tinte rojo de la mezcla inyectada permanece en el ventrículo cerebral de manera estable sin filtrarse en la agarosa circundante. Mueva la placa de montaje bajo el microscopio para localizar otro embrión montado en una posición adecuada para repeticiones. Después de inyectar de seis a ocho embriones, pelar la agarosa con un cuchillo microquirúrgico para liberar los embriones de la agarosa incrustada.
Transfiera los embriones microinyectados a un plato fresco con 30 mililitros de medio embrionario y colóquelos a temperatura ambiente para los siguientes pasos. Después de 30 minutos, transfiera los embriones seleccionados a 10 mililitros de medio embrionario. Para montar los embriones, prepare agarosa de bajo punto de fusión al 0,8% que contenga la misma concentración de tricano en el tubo.
Use una pipeta de vidrio para sumergir los embriones inyectados en la agarosa caliente durante tres segundos. Luego, retire inmediatamente los embriones de la agarosa con la misma pipeta de vidrio y coloque los embriones en el centro de los platos de cultivo de fondo de vidrio de 35 milímetros con una gota de agarosa del tubo. Oriente los embriones suavemente con una sonda de fibra o una punta de carga para mantener el lado dorsal del cerebro embrionario lo más cerca posible del fondo de vidrio.
Gire la posición del embrión suavemente para extender el embrión sin curvarse a medida que la agarosa se solidifica gradualmente. Después, verifique la posición del embrión volteando el plato con fondo de vidrio. Asegúrese de que todo el prosencéfalo dorsal con los embriones montados correctamente se pueda ver bajo el microscopio.
Agregue de dos a tres mililitros de medio embrionario precalentado de 28.5 grados centígrados que contenga tricano para cubrir el embrión. Coloque el plato correctamente en la etapa de temperatura controlada del microscopio confocal y ajuste la temperatura de la cámara de imágenes a 28.5 grados centígrados. El embrión ahora está listo para la obtención de imágenes.
Los embriones inyectados con Atto-647N mostraron fluorescencia de fondo en el ventrículo cerebral. Los embriones de pez cebra inyectados anti-Dld-Atto-647N mostraron grandes cantidades de partículas fluorescentes internalizadas en la mayoría de las células del cerebro anterior en desarrollo. Las imágenes de lapso de tiempo mostraron el movimiento de los endosomas intracelulares Anti-Dld-Atto-647N durante la división celular.
La mayoría de los progenitores mitóticos de la glía radial mostraron segregación asimétrica anterior o posterior de endosomas anti-Dld-Atto-647N en dos células hijas. La asimetría se estabilizó hacia el final de la anafase, lo que resultó en una herencia asimétrica de endosomas de señalización de muesca por las células hijas después. Asegúrese de que la aguja se haya colocado en el ventrículo oculto de la marca en el lugar correcto y verifique si hay alguna fuga después de la microinyección.
Además de etiquetar la señalización delta de muesca, el protocolo es aplicable para etiquetar otras proteínas de membrana o proteínas extracelulares utilizando estrategias similares, si se dispone de un buen anticuerpo contra el dominio extracelular.
