Este método se puede utilizar para identificar y caracterizar los elementos reguladores que controlan la traducción durante la maduración del ovocito. Aplicamos microscopia del lapso de tiempo para evaluar la acumulación del reportero a través de la maduración in vitro del oocyte. Esto señala con precisión el momento en que la activación o represión traslacional tiene lugar durante la maduración de los ovocitos.
Para comenzar, abra cuidadosamente los folículos antrales haciendo un pequeño corte en la pared del folículo con una aguja calibre 26. Aísle los AOC intactos con varias capas de células cumulus usando una pipeta de vidrio operada por la boca. Utilice una pipeta más pequeña y denude mecánicamente los AOC mediante pipeteo repetido.
Aspirar los ovocitos denudados y colocarlos en una placa de Petri con medio de maduración suplementado con un micromolar de cilostamida. Colocar el plato en una incubadora durante dos horas para dejar que los ovocitos se recuperen del estrés inducido por su aislamiento de los folículos. Coloque un tubo capilar de vidrio de borosilicato de 10 centímetros de largo en un tirador mecánico para preparar agujas de inyección.
Doble la punta de la aguja en un ángulo de 45 grados usando un filamento calentado para una inyección óptima. Coloque 20 gotitas de microlitro de medio básico de recolección de ovocitos en un plato de poliestireno y cubra las gotitas con aceite mineral ligero. Prepare un mayor volumen de mezcla de reporteros agregando 12.5 microgramos por microlitro de Ypet UTR y mCherry cada uno.
Guarde las alícuotas de estos a menos 80 grados Centígrados. Al descongelar, centrífuga la alícuota durante dos minutos a 20, 000 veces G, luego transferirlo a un nuevo tubo de microcentrífuga. Cargue la aguja de inyección con aproximadamente 0,5 microlitros de mezcla de reportero.
Coloque la pipeta de sujeción y la aguja de inyección en los soportes y colóquelos en la gota del medio de recolección de ovocitos. Abra la aguja de inyección tocándola suavemente contra la pipeta de sujeción. Coloque los ovocitos en una gota de medio de recolección básico e inyecte de cinco a 10 picolitros de la mezcla del reportero.
Incubar los ovocitos y el medio de maduración con una cilostamida micromolar durante 16 horas para permitir que la señal de mCherry se estabilice. Para la microscopía de lapso de tiempo, prepare una placa de Petri con dos gotitas de 20 microlitros de medio de maduración para cada reportero inyectado, una gotita con una cilostamida micromolar para el control de ovocitos detenidos por la fase I, y una gotita sin cilostamida para ovocitos maduros. Cubra las gotitas con aceite mineral ligero y colóquelas en la incubadora.
Después de la preincubación, retire los ovocitos inyectados de la incubadora y lávelos cuatro veces en medio de maduración sin cilostamida. Mantenga algunos ovocitos en medio de maduración con una cilostamida micromolar como grupo control de ovocitos de profase I. Transfiera los ovocitos inyectados a sus respectivas gotitas en el plato de microscopio de lapso de tiempo previamente preparado.
Agrupe los ovocitos con una pipeta de vidrio cerrada para evitar su movimiento durante la grabación. Coloque el plato bajo el microscopio equipado con un sistema de eliminación de diodos emisores de luz y una etapa motorizada equipada con una cámara ambiental mantenida a 37 grados Centígrados y 5% de dióxido de carbono, utilizando los parámetros mencionados en el manuscrito del texto. Introduzca la configuración adecuada para el experimento de lapso de tiempo haciendo clic en Aplicaciones y, a continuación, en Adquisición multidimensional.
Seleccione la primera pestaña Principal y seleccione lapso de tiempo, varias posiciones de escenario y múltiples longitudes de onda. Seleccione la pestaña Guardar para entrar en la ubicación donde se debe guardar el experimento. A continuación, seleccione la pestaña Time-Lapse para introducir el número de puntos de tiempo, la duración y el intervalo de tiempo.
Seleccione la pestaña Etapa, active brightfield y localice la posición de los ovocitos abriendo una nueva ventana y seleccionando Adquirir, Adquirir y Mostrar en vivo. Una vez que los ovocitos están ubicados, vuelva a la ventana de adquisición multidimensional y presione plus para establecer la ubicación de los ovocitos. Seleccione la pestaña Longitudes de onda y establezca tres longitudes de onda diferentes para brightfield, YFP y mCherry.
Ajuste la exposición para Ypet y mCherry, luego comience el experimento de lapso de tiempo haciendo clic en Adquirir. Para el análisis de la traducción de Ypet tres primos UTR, realice dos mediciones de la región para cada ovocito, el ovocito sí mismo haciendo clic en la región de la elipse, y una pequeña región que rodea el ovocito que se utilizará para la sustracción del fondo haciendo clic en la región rectangular. Exporte los datos de medición de la región a una hoja de cálculo haciendo clic en Abrir registro y, a continuación, en Datos de registro.
Para cada ovocito individual y para todos los puntos de tiempo medidos, reste la medición de la región de fondo de la medición de la región del ovocito por separado para las longitudes de onda YFP y mCherry. La expresión de mCherry y de YFP en la profase I y los ovocitos maduros fue registrada en 39 ovocitos, cuyo 30 fueron madurados, y nueve fueron arrestados en la profase I como control negativo. Los cocientes individuales de YFP a mCherry para las señales de los ovocitos I-arrestados y maduros de la profase fueron corregidos para el volumen inyectado dividiendo la señal de YFP por la señal media del mCherry de los 10 puntos pasados del tiempo para la profase I-arrestada y madurando los ovocitos.
Las tasas de traducción del reportero YFP se midieron ajustando la curva de la YFP a las relaciones mCherry en la profase I y en la maduración de los ovocitos durante el primer cero a dos horas, o de ocho a 10 horas después de la liberación de cilostamida mediante regresión lineal. La acumulación del reportero no sigue un patrón lineal, como lo indica una diferencia significativa en las tasas de traducción entre cero a dos horas y ocho a 10 horas después de la liberación de cilostamida, lo que indica la activación de la traducción de interleucina 7 durante la maduración miótica de los ovocitos. Al intentar este protocolo, asegúrese de que el tiempo de exposición es adecuado al principio de la grabación.
Tenga en cuenta que la señal podría saturarse durante el curso de tiempo si la traducción se activa durante la reanudación meiótica de ovocitos. La estabilidad del MRMA se puede confirmar por la polimerización en cadena, usando los cebadores para YFP. Para confirmar los cambios en la traducción, puede usar Western blotting con un anticuerpo contra una tecnología V5.
