Este protocolo proporciona conocimientos prácticos, útiles para formular partículas a nanoescala, es decir, nanodiscos, que incorporan de manera estable una amplia gama de moléculas bioactivas hidrófobas. Este método tiene muchas aplicaciones prácticas.
La capacidad de conferir solubilidad acuosa a compuestos bioactivos insolubles permite el uso de nanodiscos en aplicaciones de administración de fármacos. El método descrito es sencillo. Se prefiere realizar estudios a la escala descrita, cinco miligramos de fosfolípidos, dos miligramos de proteína de andamio, de modo que la formación de nanodiscos se controle fácilmente mediante inspección visual.
Demostrando el procedimiento estarán Michael Karo y Matthew Swackhammer, estudiantes de pregrado investigadores en el laboratorio Ryan. Para preparar una alícuota de fosfolípidos, pese cinco miligramos de DMPC y transfiérala a un tubo de ensayo de vidrio. Disuelva el fosfolípido agregando 300 microlitros de cloroformo y 100 microlitros de metanol para una proporción de tres a uno.
Evapore el disolvente orgánico colocando el tubo de ensayo de vidrio bajo una corriente suave de gas nitrógeno durante 10 a 15 minutos, de modo que se forme una película delgada de fosfolípido seco a lo largo de las paredes de la parte inferior del tubo. Para formular nanodiscos de anfotericina B o AmpB, pipetear 450 microlitros de PBS a la alícuota de fosfolípidos liofilizados, y vortex durante 30 segundos para dispersar el lípido. Pipetear 50 microlitros de 20 miligramos por mililitro de solución madre de AmpB en la muestra dispersa de fosfolípidos y vórtice.
Agregue 500 microlitros de cuatro miligramos por mililitro de proteína de andamio ApoE4 NT al tubo de ensayo de vidrio que contiene el fosfolípido disperso y AmpB. Bañe la muestra a 24 grados centígrados hasta que la solución se aclare. Para la diálisis de nanodiscos AmpB, prepare una sección del tubo de diálisis empapándolo bien en agua destilada desionizada durante 10 minutos.
Usando una abrazadera de tubo de diálisis, sujete un extremo del tubo de diálisis empapado, asegurándose de que no pueda escapar ningún líquido. Inserte un embudo de cuello estrecho en el extremo abierto del tubo de diálisis y transfiera la muestra de AmpB-Nanodisk al tubo de diálisis. Retire el embudo y sujete el extremo del tubo de diálisis con otra pinza para tubo de diálisis.
Coloque un flotador de diálisis de espuma en uno de los extremos sellados del tubo de diálisis y coloque el tubo de diálisis ensamblado en el vaso de precipitados que contiene tampón PBS de un litro recién preparado. Coloque una barra de agitación magnética en la parte inferior del vaso de precipitados y ajuste el control de agitación a bajo, asegurándose de no producir un vórtice. Permita que la diálisis continúe durante la noche a cuatro grados centígrados.
Encienda el espectrofotómetro girando el interruptor de encendido y conéctese a una computadora de soporte correspondiente presionando control de PC. En la computadora de soporte, abra el software etiquetado UVProbe 2.61 y conéctese al espectrofotómetro haciendo clic en conectar" en la esquina inferior izquierda. Haga clic en el espectro, luego haga clic en método"en la barra de herramientas superior.
Haga clic en la pestaña de medición e ingrese 500 en el cuadro de texto "inicio ubicado debajo del rango de longitud de onda, y 300 en el cuadro de texto final". Haga clic en el menú desplegable junto a la pestaña etiquetada velocidad de escaneo"y configúrelo en medio. Prepare una muestra en blanco transfiriendo un mililitro de DMSO en dos cubetas de cuarzo.
Cargue ambas cubetas en los respectivos puertos de muestra del espectrofotómetro. Haga clic en "en blanco automático" y grabe un espectro de 300 a 500 nanómetros haciendo clic en inicio" en la esquina inferior izquierda. Para el análisis espectral estándar de AmpB, retire la cubeta del puerto de muestra frontal y agregue 20 microlitros de un miligramo por mililitro de solución madre de AmpB.
Cargue la cubeta de nuevo en el tablero de muestra y haga clic en "inicio" para registrar la absorbancia de la muestra. Después de registrar la absorbancia de la muestra, retire la cubeta y decanta el contenido líquido en un contenedor de desechos. Enjuague bien la cubeta con tres lavados de agua desionizada, seguido de tres lavados con etanol al 70%.
Para el análisis espectral del nanodisco AmpB interrumpido, prepare la muestra pipeteando 20 microlitros de un miligramo por mililitro de material de nanodisco AmpB en un mililitro de DMSO e incube durante un minuto antes de registrar el espectro. Cargue la cubeta en el puerto de muestra frontal y haga clic en "iniciar" para registrar la absorbancia de la muestra. Para el análisis espectral de un espacio en blanco de tampón PBS, prepare un espacio en blanco transfiriendo un mililitro de PBS a dos cubetas de cuarzo.
Cargue las cubetas en el puerto de muestra. Haga clic en "en blanco automático" y registre el espectro de 300 a 500 nanómetros. Para el análisis espectral de una muestra de AmpB-Nanodisco no interrumpida, retire la cubeta del puerto de muestra frontal y agregue 20 microlitros de una muestra de AmpB-Nanodisco de un miligramo por mililitro en el búfer PBS.
Cargue la cubeta de nuevo en el tablero de muestra. Haga clic en "inicio" y registre el espectro de muestra. La reacción de formulación de AmpB-Nanodisk se considera completa cuando la apariencia de la muestra pasa de turbia a clara.
Se muestra la espectroscopia de absorción visible UV de muestras de AmpB en DMSO y PBS. En DMSO, se observaron tres máximos de absorbancia distintivos a 372, 392 y 415 nanómetros, picos indicativos de AmpB. Los espectros de absorbancia de los nanodiscos AmpB en PBS mostraron un único pico de absorbancia mayor en una longitud de onda más corta.
En comparación, los espectros de absorbancia de AmpB-Nanodisks en DMSO parecían similares a los espectros de AmpB stock. La actividad biológica de los nanodiscos AmpB se realizó mediante la evaluación de ensayos de inhibición del crecimiento de levaduras. Las muestras de control como PBS, DMSO y lipoproteínas de alta densidad reconstituidas demostraron que los componentes de nanodiscos distintos de AmpB no tienen un efecto discernible sobre el crecimiento de la levadura.
El control positivo confirmó que AmpB es un inhibidor eficiente del crecimiento de levadura. En el caso de los nanodiscos AmpB, se observó actividad de inhibición del crecimiento dependiente de la concentración. No todas las preparaciones de nanodiscos son iguales.
Algunos pueden requerir más tiempo, diferentes lípidos o diferentes proteínas de andamio. Lo único indistinto es la aclaración de la muestra de nanodisco. Esta técnica ha dado lugar a nuevas nanopartículas utilizadas para estudiar la cardiotoxicidad inducida por doxorrubicina, la apoptosis, las interacciones de ligandos, y ha entregado numerosas moléculas bioactivas insolubles acuosas, incluyendo luteína y curcumina.
