Agradecemos a los tres revisores anónimos por sus comentarios y sugerencias. Esta investigación fue financiada por el Fondo Especial de Investigación de BOF para JVdB (BOF Starting Grant BOF. STG.2018.0007.01), para el UGCT como Centro de Especialización (BOF. EXP.2017.0007) y como Instalación Principal (BOF. COR.2022.008), Los autores también agradecen a la Fundación de Investigación de Flandes (G019521N y G009720N) y al Fondo de Investigación Industrial (IOF) de UGent por el apoyo financiero a la infraestructura a través de la subvención IOF. APP.2021.0005 (proyecto FaCT F2021/IOF-Equip/021).

Análisis de anillos de árboles de alto rendimiento y estimación de densidad

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Pasos críticos dentro del protocolo Los pasos críticos dentro del protocolo incluyen el manejo adecuado del barrenador de incremento para obtener núcleos de incremento de alta calidad (paso 1.1. y ver39) para evitar pedazos y piezas. A continuación, es esencial que los núcleos se dejen sin montar (pero ver26), tanto para la inserción en el portamuestras (Figura 5, ver21) como para la correcta extracción de resi...

La densidad de la madera es una variable fácil de medir1 que refleja las propiedades anatómicas y químicas de la madera2. En las estimaciones de biomasa aérea, la densidad de la madera es una variable de peso importante 3,4,5, que se multiplica por las dimensiones del árbol y un factor que representa el contenido de carbono de la madera. La densidad de la madera está estrechamente ligada a las propiedades mecánicas de la madera6 y refleja la historia de vida de un árbol7.
La densidad de la pared celular se mide en aproximadamente 1500 kg/m³ y se considera bastante constante8, sin embargo, también se deben considerar las variaciones de la densidad de la pared celular dentro del anillo 8,9. Las células leñosas (en general, las traqueidas de las coníferas, los vasos, el parénquima y las fibras de las maderas duras) están orientadas/moldeadas de diferentes maneras y el grosor de la pared celular y el tamaño del lumen de estas células varían10. Por lo tanto, la densidad de la madera varía entre los árboles, dentro de un árbol (axial y transversal) y dentro de intervalos cortos dentro de un anillo de árbol11,12. En muchos casos, la variación de la densidad de la madera en la escala de anillo también delimita el límite del anillo del árbol13. La densidad de la madera y, en última instancia, las fracciones de tejido se generan y, en este artículo, se clasifican en tres categorías (es decir, tres escalas de resolución diferentes), según el objetivo del estudio (Figura 1), como se describe a continuación.
Escala entre anillos: Al medir piezas de madera, se obtiene un único valor para esa muestra. Esto se puede hacer a través de la inmersión en agua o geométricamente14. De esta manera, se pueden obtener variables tecnológicas generales de la biomasa o de la madera. Para incluir la variación de la médula a la corteza, estas piezas de madera pueden dividirse a su vez en bloques que se miden manualmente para obtener información sobre la estrategia de historia de vida15. Al cambiar a la TC de rayos X de baja resolución, como en los escáneres médicos17,18, los datos de TRW en anillos de tamaño medio a ancho se pueden obtener de manera eficiente en muchas muestras 18,19,20. Esta es también la escala que se puede utilizar para evaluar la biomasa desde la médula hasta la corteza de árboles templados y tropicales 4,22, que suele oscilar entre 50 μm y 200 μm.
Escala de anillo: La madera es un registrador de las condiciones ambientales pasadas. El parámetro más conocido es el ancho de los anillos de los árboles (TRW), pero para las reconstrucciones de la temperatura global, se ha demostrado que los registros de densidad máxima de madera tardía (MXD) son un mejor indicador de la temperatura22. MXD es una variable fácil de medir23, y un indicador del grosor de la pared celular y el tamaño de las células en las últimas células de un anillo de árbol, y se encuentran en la línea de árboles y los sitios boreales relacionados positivamente con la temperatura del aire estacional24: cuanto más cálidos y largos son los veranos, más lignificación de la pared celular se produce, lo que aumenta la densidad de estas últimas células. Las mediciones tradicionales, como la inmersión y la geometría, son menos precisas para determinar esta densidad a nivel de anillo. Un trabajo anterior desarrolló una cadena de herramientas para el uso de película de rayos X en muestras de corte fino25. Esto provocó una revolución tanto en la silvicultura como en la paleoclimatología posterior15,18, definiendo la densidad máxima de la madera tardía (MXD), es decir, el valor de la densidad máxima a menudo al final de un anillo, como un indicador de la temperatura de verano. El principio básico es que las muestras se aserran (aproximadamente de 1,2 mm a 7 mm13) para que queden perfectamente paralelas a la dirección axial, y la muestra se coloca en una película sensible expuesta a una fuente de rayos X. A continuación, estas películas radiográficas se leen a través de una fuente de luz que detecta la intensidad y guarda los perfiles y los parámetros anuales de los anillos de los árboles. Estas herramientas, sin embargo, requieren una cantidad significativa de preparación de muestras y trabajo manual. Recientemente, esto se ha desarrollado para la TC de rayos X de una manera más estandarizada o basada en núcleos montados26. La resolución aquí oscila entre 10 μm y 20 μm. TRW también se mide en esta escala, especialmente cuando se trata de anillos más pequeños.
Escala anatómica: A esta escala (resolución < 4 μm), los niveles de densidad promedio se vuelven menos relevantes a medida que se visualizan las principales características anatómicas y se pueden medir su ancho y proporciones. Por lo general, esto se hace mediante la realización de microsecciones o exploraciones ópticas de alta resolución o exploraciones μ-CT. Cuando es necesario visualizar la ultraestructura de las paredes celulares, la microscopía electrónica de barrido es el método más utilizado27. A escala anatómica, las fracciones individuales de tejido se hacen visibles para que los parámetros fisiológicos puedan derivarse de las imágenes. Sobre la base de los parámetros anatómicos individuales y la densidad de la pared celular de la madera, se puede derivar la densidad anatómica para compararla con los estimadores convencionales de la densidad de la madera24.
Debido a las técnicas de corte mejoradas y al software de imagen29,30, se ha desarrollado dendro-anatomy30 para tener un registro más preciso de la madera, tanto para tener una estimación más cercana de la MXD en coníferas como para medir varias variables anatómicas de árboles de hoja ancha. En esta escala, se miden los parámetros anatómicos reales y se relacionan con los parámetros ambientales31 . Con μCT también se puede obtener este nivel32,33.
Dado que la madera es inherentemente higroscópica y anisotrópica, la densidad de la madera debe definirse cuidadosamente y especificarse las condiciones de medición, ya sea seca en horno, acondicionada (normalmente con un contenido de humedad del 12%) o verde (talada en el bosque)34. Para muestras grandes y fines técnicos, la densidad de la madera se define como el peso dividido por su volumen en condiciones dadas. Sin embargo, el valor de la densidad de la madera depende en gran medida de la escala a la que se mide, por ejemplo, desde la médula hasta la corteza, la densidad de la madera puede duplicarse, y en una escala de anillo (en coníferas) la transición de la madera temprana a la madera tardía también da como resultado un aumento significativo en la densidad de la madera, con un pico en el límite del anillo.
Aquí, se presenta un protocolo de escaneo por TC de rayos X de núcleos incrementales con el fin de medir las características en las 3 escalas mencionadas anteriormente (Figura 1). Los desarrollos recientes en la TC de rayos X pueden cubrir la mayoría de estas escalas, debido a una configuración flexible. Los objetivos de la investigación determinarán el protocolo final para la exploración.
Un factor limitante crucial (que está inherentemente conectado a la naturaleza escamosa de la densidad de la madera y de la madera en general) es la resolución y el tiempo necesarios para el escaneo. Los ejemplos demuestran cómo: (i) obtener perfiles de densidad de madera a escala de árbol entre anillos para estimaciones de biomasa en Terminalia superba de la cuenca del Congo, (ii) obtener registros de densidad de cedro de Clanwilliam (Widdringtonia cedarbergensis) basados en escaneo helicoidal en un sistema HECTOR35, y (iii) medir los parámetros de la vasija en roble sésil, en el sistema Nanowood. Ambos escáneres forman parte del conjunto de escáneres del Centro de Tomografía de Rayos X de la Universidad de Nueva York (UGCT, por sus siglas en inglés)
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65208/65208fig01.jpg"> Figura 1: Árbol de decisión metodológico general para la tomografía computarizada de rayos X. Las filas indican los pasos a seguir, desde el objetivo de la investigación hasta el formato final de los datos. Las cajas blancas son los pasos que son relevantes para esta cadena de herramientas. Las cajas atenuadas son pasos que se pueden realizar con otro software o paquetes R, como dplr47 y Treeclim48 para el análisis de anillos de árboles, y ROXAS44 , así como ImageJ42 u otras aplicaciones (comerciales) para derivar parámetros anatómicos de la madera basados en las imágenes de TC. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65208/65208fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Investigación X-CT en madera Configuración de un escáner: Un escáner de tomografía computarizada de rayos X estándar consta de un tubo de rayos X, un detector de rayos X, una etapa de rotación y un conjunto de motores para mover la etapa de rotación y, en la mayoría de los casos, también el detector, hacia adelante y hacia atrás (Figura 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65208/65208fig02.jpg"> Figura 2. El sistema de escaneo HÉCTOR. El sistema35, que muestra la distancia del detector de fuente (SDD) y la distancia del objeto de la fuente (SOD). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65208/65208fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
La mayoría de los sistemas de laboratorio tienen una geometría de haz cónico, lo que significa que los rayos X producidos se distribuyen desde la ventana de salida del tubo en forma de haz cónico, lo que implica que al cambiar la distancia entre el objeto y el tubo (SOD = Fuente-Objeto-Distancia) y el detector y el tubo (SDD = Fuente-Detector-Distancia), se controla el aumento (consulte la discusión sobre la resolución). Debido al poder de penetración de los rayos X, atraviesan el objeto, y la intensidad del haz de atenuación es una función de la energía del haz de rayos X, la composición química del objeto (el número atómico de los elementos presentes) y la densidad del material. Dado un espectro de energía constante y una composición constante del material de la madera, la atenuación del haz de rayos X depende en gran medida de la densidad del material, lo que explica su uso para la densitometría. La atenuación (o transmisión) puede expresarse mediante la ley de Beer-Lambert:
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/65208/65208eq01.jpg" style="margin: auto;">
con I0 el haz de rayos X entrante exponencialmente que decae en un haz de rayos X transmitido Id cuando se propaga a través del material a una distancia d. El coeficiente de atenuación lineal μ depende de una serie de interacciones con el material del objeto. Por lo tanto, las proyecciones son registros del haz transmitido.
Prácticamente, el objeto se monta en la etapa de rotación, se seleccionan un SOD y un SDD adecuados, también se selecciona una cierta potencia (relacionada con el tamaño, la densidad y la composición del objeto) y el objeto se gira 360° y durante esa rotación se toman múltiples proyecciones. Estas proyecciones se utilizan para reconstruir la estructura interior del objeto. Existen varios algoritmos de reconstrucción disponibles, de los cuales los más utilizados siguen basándose en el marco analítico desarrollado hace décadas, basándose en la transformación del radón y el teorema del corte de Fourier. Para más detalles, se remite al lector a la literatura especializada36.
Enigma de la resolución, el volumen de datos y el tamaño de la muestra: La resolución es clave en la tomografía computarizada de rayos X. En los sistemas con geometría inversa, o geometría de haz paralelo, como las líneas de luz de sincrotrón, otras consideraciones juegan un papel importante. Este protocolo solo analiza la tomografía computarizada de rayos X estándar en laboratorio con geometría de haz cónico. Aquí, el concepto de ampliación, tamaño de píxel del detector y tamaño de punto son esenciales. El aumento se define como la relación SDD/SOD. A continuación, el tamaño de píxel del detector obviamente también afecta a la resolución: cuanto menor es el tamaño de píxel, mayor es la resolución, pero en la mayoría de los casos el campo de visión (FoV) también está directamente relacionado con el tamaño de píxel y el tamaño del detector (menor tamaño de píxel, menor FoV para el mismo número de píxeles). Además, el tamaño del haz de rayos X también es importante: cuanto mayor sea el tamaño del punto, menor será la resolución, lo que significa que se pueden ver menos detalles.
Es importante tener en cuenta que se puede obtener una resolución superior a la posible según los límites mencionados anteriormente, por lo que es mejor utilizar el término tamaño de vóxel (un vóxel es un píxel de volumen) en lugar de resolución. Además, hay otros factores en juego, como la nitidez del detector, que limitan aún más la resolución real a la que se escanea un objeto. Solo una verdadera calibración del sistema, utilizando objetivos establecidos, proporciona la respuesta verdadera.
Sin embargo, en la mayoría de los casos, el tamaño del vóxel en el que se puede escanear un objeto está limitado principalmente por el tamaño del objeto. Esto significa que cuanto más grande sea el objeto, menor será el tamaño del vóxel. Si el objeto no cabe dentro del campo de visión del detector para un cierto tamaño de vóxel, entonces el tamaño del vóxel se puede reducir, por ejemplo, limitando el aumento.
Es importante tener en cuenta el tiempo de escaneo y el volumen de datos a la hora de decidir el tamaño de vóxel deseado. En general, cuanto menor sea el tamaño del vóxel, mayor será el detalle que se desea ver, cuanto más pequeña sea la muestra o menos muestras se puedan escanear a la vez, se requiere más tiempo y se recopilarán mayores volúmenes de datos. Imaginemos el siguiente ejemplo teórico: se puede escanear una muestra de 10 cm x 10 cm x 10 cm a 50 μm de una sola vez con un determinado sistema de TAC de rayos X y se desea escanear ese mismo volumen a 10 μm, el volumen que cabe dentro del campo de visión sería solo de 2 cm x 2 cm x 2 cm, asumiendo que esto es físicamente posible. Esto significa que se necesitan 125 escaneos (5³ = 5 veces mayor resolución, escala a la potencia de 3 debido a la naturaleza volumétrica de la técnica de imagen) para cubrir todo el volumen, y que el volumen de datos aumentaría igualmente. Por supuesto, esto es solo un experimento mental, y uno necesita considerar mucho más que solo la resolución. Para obtener más información, se remite al lector a una descripción general de las posibilidades de escaneo37.
Flexibilidad de los instrumentos para el escaneo de objetos de madera: En la última década, muchas empresas han suministrado sistemas de TC de rayos X con un montaje similar al HECTOR35. En38 se ofrece una visión general de varios sistemas de TC, especialmente evaluados por su resolución temporal.
En general, la flexibilidad y la facilidad de uso de los sistemas de TC de rayos X han mejorado considerablemente. Muchos sistemas permiten el escaneo de una amplia gama de objetos, lo que también es el caso de los sistemas de UGCT. El siguiente protocolo se muestra para el sistema HÉCTOR, que es adecuado para el análisis de anillos de árboles. Sin embargo, el protocolo es válido para cualquier otro sistema disponible si la resolución y el formato de los datos lo permiten.
Estos sistemas permiten el escaneo de una variedad de objetos. En la Figura 3 se muestran algunas imágenes de diferentes objetos de madera escaneados con el sistema HÉCTOR. Es esta flexibilidad la que comprende las tres escalas que presentamos en la Figura 1, que van desde una resolución gruesa hasta una resolución muy fina.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65208/65208fig03.jpg"> Figura 3. Ejemplos de configuración de escaneo. (A) Un tronco, (B) un violonchelo49, (C) portamuestras (tipo 1) con núcleos de árbol para el escaneo por lotes y (D) portamuestras tipo 2 con núcleos de incremento para el escaneo helicoidal montados en la etapa de rotación de HECTOR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65208/65208fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6 mm paper straws&#160;</td>
			<td>http://artstraws.com/education/product/artstraws-thick-asst-cols/</td>
			<td></td>
			<td>Coring</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium core holders</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ASTM standard ASTM D 1107 &#8211; 96</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardboard postal tubes</td>
			<td>https://www.rajapack.co.uk/envelopes-mailing-bags/postal-tubes/1-5-2mm-brown-cardboard-postal-tubes_PDT05623.html</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Column drill</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer hardware for reconstruction and analysis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>X-ray CT scanning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooling&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drying oven</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flask for under soxhlet (2000 ml)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floral foam</td>
			<td>https://www.oasisfloral.eu/</td>
			<td></td>
			<td>Sample holder type 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads to fill void volume of Soxhlet to save solvent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glue</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot water bath&#160;</td>
			<td>https://www.memmert.com/products/water-baths/water-bath/#!filters=%7B%7D</td>
			<td></td>
			<td>Soxhlet extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Increment borer&#160;</td>
			<td>https://haglofsweden.com/project/increment-borers/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cylinder&#160;</td>
			<td>Moonen et al. 2022&#160;</td>
			<td></td>
			<td>Sample holder type 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cylinders</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reservoir</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tailored soxhlet apparatus&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluene&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water pump&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray CT scanner</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tree core analysis with x-ray computed tomography

Se presenta una cadena de herramientas de tomografía computarizada (TC) de rayos X para obtener el ancho del anillo del árbol (TRW), la densidad máxima de la madera tardía (MXD), otros parámetros de densidad y datos cuantitativos de la anatomía de la madera (QWA) sin la necesidad de un tratamiento de superficie intensivo en mano de obra ni ninguna preparación de muestra física. En este caso, la atención se centra en los núcleos de incremento y los procedimientos de escaneo con resoluciones que van desde 60 μm hasta 4 μm. Se definen tres escalas en las que se debe observar la madera: (i) escala entre anillos, (ii) escala de anillos, es decir, análisis de anillos de árboles y escala de densitometría, así como (iii) escala anatómica, esta última acercándose a la calidad convencional de sección delgada. Los portamuestras diseñados a medida para cada una de estas básculas permiten el escaneo de alto rendimiento de múltiples núcleos de incremento. Se desarrollaron específicamente una serie de rutinas de software para tratar de manera eficiente las imágenes de TC de rayos X tridimensionales de los núcleos de los árboles para TRW y densitometría. En este trabajo se explican brevemente los principios básicos de la TC, necesarios para una correcta comprensión del protocolo. Se presenta el protocolo para algunas especies conocidas que se utilizan habitualmente en dendrocronología. La combinación de estimaciones aproximadas de densidad, datos TRW y MXD, así como datos cuantitativos de anatomía, nos permite ampliar y profundizar los análisis actuales para las reconstrucciones climáticas o la respuesta de los árboles, así como desarrollar aún más el campo de la dendroecología/climatología y la arqueología.

Wood density is an easy-to-measure variable1 that reflects both the anatomical and chemical properties of the wood2. In biomass estimations of aboveground biomass, wood density is an important weighing variable 3,4,5, that is multiplied with the dimensions of the tree and a factor representing the carbon content of the wood. Wood density is tightly linked to the mechanical properties of timber6 and reflects the life history of a tree7.
Cell wall density is measured as being approximately 1500 kg/m&#179; and is considered fairly constant8, however intra-ring cell wall density variations should be considered as well8,9.Woody cells (in general tracheids in conifers, vessels, parenchyma and fibers in hardwoods) are oriented/shaped in different ways and cell wall thickness and lumen size of these cells varies10. Therefore, wood density varies between trees, within a tree (axial and transversal) and within short intervals within a tree ring11,12. In many cases the wood density variation at the ring scale also delimits the tree ring boundary13. Wood density and ultimately tissue fractions are generated and in this paper are broadly put into three categories (i.e., three different resolution scales), depending on the study goal (Figure 1) as described below.
Inter-ring scale: By measuring pieces of wood, a single value is obtained for that sample. This can be done through water immersion or geometrically14. This way, general biomass or wood technological variables can be obtained. To include pith-to-bark variation, these pieces of wood can be further divided into blocks that are measured manually to obtain information on the life history strategy15. When switching to low-resolution X-ray CT such as in medical scanners17,18, TRW data on medium-to-wide rings can be made in an efficient way on many samples18,19,20. This is also the scale that can be used to assess biomass from pith-to-bark from both temperate and tropical trees4,22, typically ranging in resolutions from 50 &#181;m to 200 &#181;m.
Ring scale: Wood is a recorder of past environmental conditions. The best known parameter is tree-ring width (TRW), but for global temperature reconstructions, maximum latewood density (MXD) records are proven to be a better proxy for temperature22. MXD is an easy-to-measure variable23, and a proxy for cell wall thickness and cell size on the last cells of a tree ring, and are at tree line and boreal sites positively linked to seasonal air temperature24: the warmer and longer the summers, more cell wall lignification occurs which thus increases the density of these last cells. Traditional measurements such as immersion and geometry are less accurate to determine this ring-level density. A previous work developed a toolchain for using X-ray film on thin-cut samples25. This sparked a revolution in both forestry and later paleoclimatology15,18, defining maximum latewood density (MXD), i.e., the peak density value often at the end of a ring, as a proxy for summer temperature. The basic principle is that the samples are sawn (approximately 1.2 mm to 7 mm13) to be perfectly parallel to the axial direction, and the sample is put on a sensitive film exposed to an X-ray source. Then these radiography films are read out through a light source that detects the intensity and saves the profiles and the annual tree ring parameters. These tools, however, require a significant amount of sample preparation and manual work. Recently this has been developed for X-ray CT in a more standardized way or based on mounted cores26. Resolution here ranges between 10 &#181;m and 20 &#181;m. TRW is measured on this scale as well, especially when dealing with smaller rings.
Anatomical scale: At this scale (resolution &#60; 4 &#181;m), the average density levels become less relevant as the main anatomical features are visualized and their width and proportions can be measured. Typically, this is done through making microsections or high-resolution optical scans or &#181;-CT scans. When the ultrastructure of the cell walls needs to be visualized, scanning electron microscopy is the most commonly used method27. At the anatomical scale, the individual tissue fractions become visible so that physiological parameters can be derived from the images. Based on the individual anatomical parameters and the cell wall density of wood, anatomical density can be derived for comparison with conventional estimators of wood density24.
Due to improved sectioning techniques and image software29,30, dendro-anatomy30 has been developed to have a more accurate record of the wood, both to have a closer estimate of the MXD in conifers and to measure several anatomical variables from broadleaf trees. On this scale, actual anatomical parameters are measured and related to environmental parameters31 . With &#181;CT this level can be obtained as well32,33.
As wood is inherently hygroscopic and anisotropic, wood density needs to be carefully defined and the measurement conditions need to be specified, either as oven-dry, conditioned (typically at 12% moisture content) or green (as felled in the forest)34. For large samples and technical purposes, wood density is defined as the weight divided by its volume at given conditions. However, the value of wood density is strongly dependent on the scale at which it is measured, for instance from pith-to-bark wood density can double, and on a ring scale (in conifers) the transition of earlywood to latewood results in a significant rise in wood density as well, with a peak at the ring boundary.
Here, an X-ray CT scanning protocol of increment cores is presented in order to measure features at the aforenoted 3 scales (Figure 1). Recent developments in X-ray CT can cover most of these scales, due to a flexible set-up. The research goals will determine the eventual protocol for scanning.
A crucial limiting factor (which is inherently connected to the scaled nature of wood density and wood in general) is the resolution and time necessary for scanning. Examples demonstrate how to: (i) obtain inter-ring tree scale wood density profiles for biomass estimations in Terminalia superba from the Congo Basin, (ii) obtain density records from Clanwilliam cedar (Widdringtonia cedarbergensis) based on helical scanning on a HECTOR system35, and (iii) measure vessel parameters on sessile oak, on the Nanowood system.&#160;Both scanners are part of the suite of scanners at the UGent Center for X-ray Tomography (UGCT,
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65208/65208fig01.jpg" /> 
Figure 1: General methodological decision tree for X-ray CT scanning. The rows indicate the steps to take, starting from the research goal all the way to the final data format. White boxes are the steps that are relevant for this toolchain. Greyed-out boxes are steps that can be performed with other software or R packages, such as dplr47 and Treeclim48 for tree-ring analysis, and ROXAS44 as well as ImageJ42 or other (commercial) applications for deriving wood anatomical parameters based on the CT images. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65208/65208fig01large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
X-CT research on wood 
Set-up of a scanner: A standard X-ray CT scanner consists of an X-ray tube, an X-ray detector, a rotation stage, and a set of motors to move the rotation stage, and in most cases also the detector, back and forth (Figure 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65208/65208fig02.jpg" /> 
Figure 2. The HECTOR scanning system. The system35, showing the source detector distance (SDD) and the source object distance (SOD). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65208/65208fig02large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
Most lab-based systems have a cone-beam geometry, which means that the produced X-rays are distributed from the tube&#39;s exit window in a cone-beam shape, implying that by changing the distance between the object and the tube (SOD = Source-Object-Distance) and the detector and the tube (SDD = Source-Detector-Distance), the magnification is controlled (see the discussion on resolution). Due to the penetrating power of X-rays, they pass through the object, and the intensity of the attenuation beam is a function of the energy of the X-ray beam, the chemical composition of the object (the atomic number of the elements present) and the density of the material. Given a constant energy spectrum&#160;and a constant material composition of wood, the attenuation of the X-ray beam is highly dependent on the density of the material, which explains its use for densitometry. The attenuation (or transmission) can be expressed by the Beer-Lambert law:
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/65208/65208eq01.jpg" style="margin: auto;" />
with I0 the incoming X-ray beam exponentially which decays to a transmitted X-ray beam Id when propagating through the material over a distance d. The linear attenuation coefficient &#181; depends on a series of interactions with the material of the object. The projections are thus recordings of the transmitted beam.
Practically, the object is mounted on the rotation stage, a proper SOD and SDD are selected, a certain power is selected as well (related to object size, density, and composition) and the object is rotated 360&#176; and during that rotation multiple projections are taken. These projections are then used to reconstruct the interior structure of the object. There are several reconstruction algorithms available, of which the most used ones are still based on the analytical framework developed decades ago, relying on the Radon transformation and the Fourier slice theorem. For more details, the reader is referred to specialized literature36.
Conundrum of resolution, data volume and sample size: Resolution is key in X-ray CT scanning. In systems with inverse geometry, or parallel beam geometry such as synchrotron beamlines, other considerations play a role. This protocol only discusses standard lab-based X-ray CT scanning with cone-beam geometry. Here, the concept of magnification, detector pixel size and spot size are essential. Magnification is defined as the ratio of SDD/SOD. Next, the pixel size of the detector obviously also impacts the resolution: the smaller the pixel size, the higher the resolution, but in most cases the field of view (FoV) is also directly related to pixel size and size of the detector (smaller pixel size, smaller FoV for the same number of pixels). Further, the spot size of the X-ray beam is also important: the larger the spot size, the lower the resolution, which means that less details can be seen.
It is important to address that one could obtain a resolution that is higher than what is possible according to the abovementioned limits, therefore it is better to use the term voxel size (a voxel is a volume pixel) instead of resolution. Moreover, there are other factors at play, such as detector sharpness, which further limit the true resolution at which an object is scanned. Only a true calibration of the system, using established targets, supplies the truthful answer.
In most cases, however, the voxel size at which an object can be scanned is mostly limited by the size of the object. This means that the larger the object, the lower the voxel size will be. If the object does not fit within the FoV of the detector for a certain voxel size, then the voxel size can be reduced, e.g., by limiting the magnification.
Scan time and data volume are important to consider when deciding the desired voxel size. In general, the smaller the voxel size means the higher the detail one wants to see, the smaller the sample or the fewer samples that can be scanned at once, more time is required and larger the data volumes will be collected. Imagine the following theoretical example: one can scan a sample measuring 10 cm x 10 cm x 10 cm at 50 &#181;m at once with a certain X-ray CT system and would like to scan that same volume at 10 &#181;m, the volume that fits within the FoV would only be 2 cm x 2 cm x 2 cm, assuming that this is physically possible. This means that 125 scans are needed (5&#179; = 5 times higher resolution, scales to the power of 3 due to the volumetric nature of the imaging technique) to cover the entire volume, and that the data volume would increase likewise. Of course, this is only a thought experiment, and one needs to consider much more than only resolution. For more information, the reader is referred to an overview of the scanning possibilities37.
Flexibility of instruments for scanning of wooden objects: In the last decade, many companies have delivered X-ray CT systems with a similar assembly as HECTOR35. An overview of several CT systems, especially assessed for their temporal resolution, is given in38.
In all, the flexibility and user-friendliness of X-ray CT systems has improved considerably. Many systems allow scanning of a diverse range of objects, which is also the case with the systems at UGCT. The protocol below is demonstrated for the HECTOR system, which is suitable for tree-ring analysis. The protocol however is valid for any other available system if resolution and data format allows for it.
These systems allow the scanning of a variety of objects. A few pictures of different wooden objects scanned with the HECTOR system are given in Figure 3. It is this flexibility that comprises the three scales we present in Figure 1, ranging from a coarse resolution to a very fine resolution.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65208/65208fig03.jpg" /> 
Figure 3.&#160;Scanning set-up examples. (A) A log, (B) a cello49, (C) sample holders (type 1) with tree cores for batch scanning and (D) sample holder type 2 with increment cores for helical scanning mounted on the rotation stage of HECTOR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65208/65208fig03large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

Autor destacado: Avances en la cadena de herramientas de TC de rayos X para el análisis de núcleos de árboles

Análisis del núcleo del árbol con tomografía computarizada de rayos X

The scope of my research is to study wood growth and its response to climate. The questions I'm trying to answer is, how can we reconstruct the climate of the past and what is the tree response to current climate change? So the current experimental challenges that we face are among others, the large data volumes that we obtain with x-ray CT scanning.So we need to find a proper balance between the number of samples that we want to scan and the required resolution. The X-ray CT techniques has allowed us to scan three core at an unprecedented rate. We have density profiles both from tropical and temperate regions.So the main advantages that we have with our technique is that we can do a lot of high throughput scanning and analysis, but also that all the indications and manipulations that we do are traceable along the entire tool chain, including the tree ring indications. This tool will allow us to update current to maximum later density chronologies, and also measure wood properties on tree course from all over the world, especially in regions where there's little data available.

Si el objetivo es la estimación de la biomasa o el incremento del crecimiento de los árboles de muchas muestras, es decir, la escala entre anillos (Figura 1), se utiliza el portamuestras 1 (Figura 5) para escanear las muestras y obtener perfiles de densidad (véase el paso 5.4.3) y estimaciones del crecimiento de los árboles, por ejemplo, para árboles de crecimiento rápido con TRW grande, lo que permite una resolución más gruesa. La F...

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Advancements in X-ray CT Tool Chain for Tree Core Analysis at JoVE.com

Aquí mostramos cómo procesar núcleos de árboles con una cadena de herramientas de tomografía computarizada de rayos X. A excepción de la extracción química para algunos fines, no se necesita ningún tratamiento físico de laboratorio adicional. La cadena de herramientas se puede utilizar para estimaciones de biomasa, para obtener datos MXD/ancho de anillo de árbol, así como para obtener datos cuantitativos de anatomía de la madera.

An X-ray computed tomography (CT) toolchain is presented to obtain tree-ring width (TRW), maximum latewood density (MXD), other density parameters, and ...

El alcance de mi investigación es estudiar el crecimiento de la madera y su respuesta al clima. Las preguntas que estoy tratando de responder son, ¿cómo podemos reconstruir el clima del pasado y cuál es la respuesta de los árboles al cambio climático actual? Por lo tanto, los desafíos experimentales actuales a los que nos enfrentamos son, entre otros, los grandes volúmenes de datos que obtenemos con la tomografía computarizada de rayos X.Por lo tanto, debemos encontrar un equilibrio adecuado entre el número de muestras que queremos escanear y la resolución requerida. Las técnicas de tomografía computarizada de rayos X nos han permitido escanear tres núcleos a una velocidad sin precedentes. Contamos con perfiles de densidad tanto de regiones tropicales como templadas.Por lo tanto, las principales ventajas que tenemos con nuestra técnica es que podemos hacer una gran cantidad de escaneo y análisis de alto rendimiento, pero también que todas las indicaciones y manipulaciones que hacemos son rastreables a lo largo de toda la cadena de herramientas, incluidas las indicaciones de los anillos de los árboles. Esta herramienta nos permitirá actualizar las cronologías actuales a las de máxima densidad tardía, y también medir las propiedades de la madera en el curso de los árboles de todo el mundo, especialmente en regiones donde hay pocos datos disponibles.

tree-core-analysis-with-x-ray-computed-tomography

Research

JoVE Journal

Environment

Tree Core Analysis with X-ray Computed Tomography

727 vistas.  University of Liège. El alcance de mi investigación es estudiar el crecimiento de la madera y su respuesta al clima. Las preguntas que estoy tratando de responder son, ¿cómo podemos reconstruir el clima del pasado y cuál es la respuesta de los árboles al cambio climático actual? Por lo tanto, los desafíos experimentales actuales a los que nos enfrentamos son, entre otros, los grandes volúmenes de datos que obtenemos con la tomografía computarizada de rayos X.Por lo tanto, debemos encontrar un equi...

Video: Autor destacado: Avances en la cadena de herramientas de TC de rayos X para el análisis de núcleos de árboles

An X-ray computed tomography (CT) toolchain is presented to obtain tree-ring width (TRW), maximum latewood density (MXD), other density parameters, and quantitative wood anatomy (QWA) data without the need for labor-intensive surface treatment or any physical sample preparation. The focus here is on increment cores and scanning procedures at resolutions ranging from 60 &#181;m down to 4 &#181;m. Three scales are defined at which wood should be looked at: (i) inter-ring scale, (ii) ring scale, i.e., tree-ring analysis and densitometry scale, as well as (iii) anatomical scale, the latter approaching the conventional thin-section quality. Custom-designed sample holders for each of these scales enable high-throughput scanning of multiple increment cores. A series of software routines were specifically developed to efficiently treat three-dimensional X-ray CT images of the tree cores for TRW and densitometry. This work briefly explains the basic principles of CT, which are needed for a proper understanding of the protocol. The protocol is presented for some known species that are commonly used in dendrochronology. The combination of rough density estimates, TRW and MXD data, as well as quantitative anatomy data, allows us to broaden and deepen current analyses for climate reconstructions or tree response, as well as further develop the field of dendroecology/climatology and archeology.

Here we show how to process tree cores with an X-ray computed tomography toolchain. Except for chemical extraction for some purposes, no further physical lab treatment is needed. The toolchain can be used for biomass estimations, for obtaining MXD/tree-ring width data as well as for obtaining quantitative wood anatomy data.

Investigación

Medio ambiente

Tree Core Sampling for X-ray Computed Tomography

To begin, core a tree using a Pressler borer. Put the tree cores, unglued, into six-millimeter paper straws and mark the straws using a pencil. Fill the round-bottom flask with solvent and place the straw onto a stainless steel support in the Soxhlet apparatus with a cooler on a laboratory heater.After siphoning, dry the cores for 24 hours in an oven at 103.5 degrees Celsius under exhaust ventilation. The next day, perform a hot-water Soxhlet extraction for 24 hours. Place the samples in the steel sample holders and dry them again for 24 hours.Then place the cores from the steel sample holder back in the straws.

Muestreo de núcleos de árboles para tomografía computarizada de rayos X

Optimizing Scanning Techniques for Biomass Estimation, Tree Growth, and Anatomical Analysis at Different Scales

To begin core scanning, depending on the research purpose, select the proper sample holder type, load the tree cores in paper straws into the sample holder, and record the position of each core in the downloadable spreadsheet template. Perform X-ray micro CT scanning following proper settings and scanning protocol. To obtain density values, install CoreProcessor, RingIndicator, and CoreComparison toolboxes using the given link.Next for pre-processing the core volumes with the CoreProcessor, select the folder with the reconstructed 16-bit cross-sectional TIFF slices in the spreadsheet file. Select a couple of slices for inspection. Then select dark and white references as indicated in the spreadsheet file for wood density calculations.In a new popup window, following the information from the spreadsheet file, select every core separately by drawing a circle or ellipse around it. Then click on Mass core extraction to extract all the cores in a given cylinder. In the CoreProcessor toolbox, click on Manual TG correction then select the extracted folder and ensure proper orientation of the transversal and radial plane of every core volume.To visualize grain direction from the bottom right plot, observe the presented slice and draw a line indicating grain direction. Double click to automatically rotate the core. Then crop the core volume to get only wood and no other material.Open the RingIndicator toolbox and select a multi-page TIFF file. Then under a Volume tab, inspect the graphical user interface in the transverse and radial plane. For structural correction on the transverse and radial plane, click on the image to insert green bars starting with the pith and ending with the most recent ring.Once a green bar is placed on one plane, it automatically generates on other planes. Click Densitometry, then Densitometry plot to calculate the density profile. Create and plot a density profile by selecting Overlay plotting, and then Plot density profile.Once the density profile is visualized, indicate all tree rings. Move the nodes at the end of the bar to change the angle. Then change the bar position using the middle node and adjust the size of the nodes.Press Data, then Export. Press Rings followed by Export rings to ensure ring and fiber indications are written in the proper txt files. Change the felling date to the year when the cores were taken from the living trees, or choose an appropriate date.In Overlay plotting, select Plot rings to display the years. Also choose the plane to plot rings or the density profile. After indicating two cores, open the CoreComparison toolbox for comparing the ring width series.Select the txt files to compare. Then a screen displaying ring widths and cross dating and statistical parameters, such as glysophikite and spearman correlation between individual series will open. Open a ring indicator instance to adjust the green bars and export them again.Then maximize the core comparison screen and press the Refresh button to reevaluate the metrics. Next, select Plotting and exporting, then Ring width to visualize the tree ring width or TRW data. Click Clotting and exporting, then export RW data to export TRW data in a spreadsheet or Tucson format.Finally, select the Other plotting, then Export cluster data for obtaining mean density, MXD, MND, and quartile data per tree ring. This study demonstrates three levels of biomass estimation or tree growth increment at the inter ring, ring, and anatomical scale. Radial and axial wood density trends in Terminalia superba demonstrated an increasing density trend from pith to bark and a higher wood density in the upper stem.An example of chronology development with minimum density and maximum latewood density from Widdringtonia cedarbergensis is shown. A high resolution oak core scan demonstrated that earlywood and latewood vessels are segmented.