La detección y localización de proteínas son esenciales en la investigación biológica. Nuestro protocolo describe una novedosa tecnología de etiquetado EM utilizando etiquetas codificadas genéticamente que permite la visualización de una sola molécula in situ con una ultraestructura bien conservada. Es crucial evitar la fijación excesiva.
El método de etiquetado se basa en la actividad de las cisteínas en las etiquetas, que son altamente sensibles a la reticulación de aldehído. Nuestro protocolo evita el uso de fijadores de aldehído y preserva la actividad de la etiqueta y la ultraestructura. al mismo tiempo.
El etiquetado EM siempre ha sido un desafío, sufriendo de una morfología deficiente o un etiquetado ineficiente. Nuestros protocolos sintetizan nanopartículas in situ directamente en proteínas individuales para proporcionar una localización clara y precisa de las proteínas objetivo, con una alta relación señal-ruido, alta eficiencia y especificidad. Hasta ahora hemos logrado un excelente etiquetado en proteínas aisladas, células de E. coli, células de levadura y células HeLa.
Exploraremos y optimizaremos el método para su aplicación a muestras de tejido. La combinación de las tecnologías crio-FIB y crio-EM prevalecientes nos permitirá abordar importantes cuestiones biológicas.
