Il rilevamento e la localizzazione delle proteine sono essenziali nella ricerca biologica. Il nostro protocollo descrive una nuova tecnologia di etichettatura EM che utilizza tag codificati geneticamente che consente la visualizzazione di singole molecole in situ con un'ultrastruttura ben conservata. È fondamentale evitare un'eccessiva fissazione.
Il metodo di etichettatura si basa sull'attività delle cisteine nelle etichette, che sono altamente sensibili alla reticolazione aldeidica. Il nostro protocollo evita l'uso di fissativi aldeidici e preserva l'attività del tag e l'ultrastruttura. allo stesso tempo.
L'etichettatura EM è sempre stata impegnativa, soffrendo di scarsa morfologia o etichettatura inefficiente. I nostri protocolli sintetizzano nanoparticelle in situ direttamente sulle singole proteine per fornire una localizzazione chiara e precisa delle proteine bersaglio, con un elevato rapporto segnale-rumore, alta efficienza e specificità. Finora abbiamo ottenuto un'eccellente etichettatura in proteine isolate, cellule E.coli, cellule di lievito e cellule HeLa.
Esploreremo e ottimizzeremo il metodo per l'applicazione a campioni di tessuto. La combinazione delle tecnologie crio-FIB e crio-EM prevalenti ci consentirà di affrontare importanti questioni biologiche.
