A detecção e localização de proteínas são essenciais na pesquisa biológica. Nosso protocolo descreve uma nova tecnologia de marcação em EM, usando tags codificados geneticamente, que permite a visualização de uma única molécula in situ com ultraestrutura bem preservada. É crucial evitar a fixação excessiva.
O método de marcação é baseado na atividade das cisteínas nas etiquetas, que são altamente sensíveis à reticulação de aldeídos. Nosso protocolo evita o uso de fixadores de aldeídos e preserva a atividade do tag e a ultraestrutura. ao mesmo tempo.
A rotulagem EM sempre foi desafiadora, sofrendo de má morfologia ou rotulagem ineficiente. Nossos protocolos sintetizam nanopartículas in situ diretamente em proteínas individuais para fornecer localização clara e precisa das proteínas-alvo, com alta relação sinal-ruído, alta eficiência e especificidade. Até agora, conseguimos excelente marcação em proteínas isoladas, células de E.coli, células de levedura e células HeLa.
Exploraremos e otimizaremos o método para aplicação em amostras de tecido. A combinação das tecnologias predominantes de crio-FIB e crio-EM nos permitirá abordar questões biológicas importantes.
