Esta investigación fue apoyada en parte por el Programa de Investigación Intramuros de los NIH, NIDCD a M.H. (DC000088)

Todos los experimentos y procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales del Instituto Nacional de Enfermedades Neurológicas y Accidentes Cerebrovasculares y el Instituto Nacional de la Sordera y Otros Trastornos de la Comunicación, Institutos Nacionales de Salud. Todos los protocolos experimentales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales del Instituto Nacional de Enfermedades Neurológicas y Accidentes Cerebrovasculares y el Instituto Nacional de la Sordera y Otros Trastornos de la Comunicación, Institutos Nacionales de Salud. Todos los métodos se llevaron a cabo de acuerdo con las pautas y regulaciones relevantes del Comité de Cuidado y Uso de Animales del Instituto Nacional de Enfermedades Neurológicas y Accidentes Cerebrovasculares y el Instituto Nacional de la Sordera y Otros Trastornos de la Comunicación, Institutos Nacionales de Salud.
1. Eutanasia animal
<ol><li>Utilizar ratones transgénicos C57BL/6J o Kcnj10-ZsGreen, postnatal día 30+ (P30+), que pesen entre 15-20 g.</li>
	<li>Eutanasia a un ratón adulto (de P30 años o más) utilizando un protocolo aprobado (aquí asfixia porCO2 ). Realizar la decapitación como paso secundario. NOTA: Si se inmunotinción, algunos anticuerpos pueden tener señal de fondo debido a la unión inespecífica a la sangre en los capilares del SV. La perfusión cardíaca con fijador puede abordar este problema mediante la eliminación de sangre de los capilares del SV. Sin embargo, la mayoría de los anticuerpos pueden lograr buenos resultados sin este método, y no estará cubierto en este protocolo.</li>
</ol>2. Exponer el laberinto óseo
<ol><li>Limpie el ratón rociando con etanol al 70% y limpiando con una toalla de papel. Preste especial atención a la región de la cabeza para reducir el riesgo de contaminación. Retire la piel del cráneo tirando de la piel hacia la nariz.</li>
	<li>Usando tijeras afiladas, divida el cráneo a lo largo del plano sagital medio para separar las porciones izquierda y derecha.</li>
	<li>Retire el cerebro del cráneo para exponer el laberinto óseo.</li>
</ol>3. Extracción del oído interno
<ol><li>Identifique el oído interno dentro del hueso temporal (Figura 2A) y raspe los nervios craneales usando pinzas #55. NOTA: El usuario debe estabilizar la muestra con su mano no dominante usando un segundo juego de pinzas #55. Se pueden agarrar diferentes áreas de la muestra con las pinzas estabilizadoras a lo largo de la disección si se evitan áreas críticas de la muestra (p. ej., no aplastar la cóclea).</li>
	<li>Usando pinzas #55, disecciona la bulla y la cápsula, separándolas del hueso circundante. Retire cualquier tejido blando restante de la superficie del oído interno.</li>
	<li>Transfiera la muestra a una placa de cultivo de tejido transparente que contenga 1x PBS frío (solución salina tamponada con fosfato), pH 7.4, y colóquela bajo un endoscopio de disección (Figura 2B).</li>
</ol>4. Disección SV
NOTA: Con la práctica, es posible diseccionar el SV como una pieza larga que se asemeja a una cinta. El SV es frágil, por lo que si se rompe en pedazos, estos pueden almacenarse juntos. Alternativamente, estos pueden almacenarse en pozos etiquetados por separado de acuerdo con su giro (por ejemplo, basal, medio, apical).
<ol><li>Si se pueden mover las fuentes de luz del endoscopio de disección, coloque una luz sobre el plato y la segunda fuente de luz desde el lado, paralela a la superficie de disección. Esto permite un mejor contraste del tejido debajo del hueso coclear.</li>
	<li>Usando pinzas #55, sostenga la muestra por la porción vestibular con la cóclea hacia arriba.</li>
	<li>Usando pinzas #55, perfore el hueso coclear en el ápice. NOTA: Los fórceps #5 son más gruesos que #55 y pueden usarse para romper huesos, pero el aumento en tamaño / fuerza sacrifica la finura de los fórceps y la capacidad de manipular tejidos pequeños. Considere usar fórceps hechos con un material como inox o dumostar para evitar daños que pueden ocurrir a los fórceps más delicados. Evite empujar los fórceps demasiado profundo debajo del hueso para evitar dañar el SV.</li>
	<li>Usando pinzas #55, raspe a lo largo del giro apical (Figura 2C), aplicando una fuerza suave para romper pequeños trozos de la capa ósea externa. Levante suavemente el hueso y sepárelo de la pared lateral. NOTA: Puede ser útil pensar en esta disección como "eliminar todo de la SV", en lugar de "diseccionar la SV de la cóclea".</li>
	<li>Continúe usando fórceps #55 para extraer las piezas óseas cocleares de las vueltas apical y media (Figura 2D, E). Empujando suavemente hacia abajo la pared lateral, haga palanca y retire las piezas de la pared ósea hacia el giro medio para exponer la pared lateral de los giros apicales y medios.</li>
	<li>Continuando usando pinzas #55, empuje suavemente la pared lateral de giro apical a un lado para exponer el ganglio espiral. Separe la pared lateral de los giros apicales y medios del ganglio espiral a lo largo de la capa externa de células ciliadas. Retire pedazos de ganglio espiral del interior de la cóclea. NOTA: Las pinzas #55 son más pequeñas y proporcionan una ventaja al manipular tejidos pequeños y delicados. Se debe tener especial cuidado para evitar doblarlos o dañarlos.</li>
	<li>Para tener un mejor acceso a la pared lateral del giro basal, separe la cóclea de la porción vestibular del hueso temporal usando pinzas # 55. Coloque las pinzas #55 en la ventana redonda y ovalada y empuje hacia abajo hacia el vestíbulo. La cóclea se desprenderá. Retire la porción vestibular del oído interno.</li>
	<li>Continuando usando pinzas #55, ahora retire pedazos de hueso coclear basal, comenzando desde el área de giro medio. Empuje suavemente la capa de la pared lateral debajo del hueso para desprenderlo.</li>
	<li>Retire la parte basal más lejana de la pared lateral haciendo palanca y tirando suavemente del tejido. El hueso en esta región puede ser demasiado grueso para ser removido sin dañar el tejido blando debajo.</li>
	<li>Ahora, con la parte basal de la pared lateral separada, separe la mayor parte posible de la pared lateral de la cóclea. Esto se puede hacer trazando las pinzas #55 a lo largo de la pared lateral. Cepille suavemente las pinzas entre el hueso y la pared lateral restante. Esto se puede hacer hasta el ápice en una sola pieza si el usuario tiene experiencia. Mueva la pared lateral a PBS nuevo. NOTA: Aunque las piezas más grandes de SV pueden ser más fáciles de visualizar, dada la naturaleza delicada de los tejidos, se pueden tomar piezas más pequeñas (Figura 2F, G) y, dependiendo del tamaño, también pueden funcionar para obtener imágenes.</li>
	<li>Use pinzas #55 para colocar la pared lateral plana. El SV debe ser visible como una capa más oscura de tejido en el lado interno de la pared lateral. NOTA: Los usuarios pueden encontrar, particularmente más cerca del extremo apical, que parte del tejido SV se desprende incidentalmente de la pared lateral a lo largo de la disección.</li>
	<li>Haga palanca suavemente con la capa SV para separarla de la pared lateral en su extremo basal (Figura 2H). Empuje suavemente a un lado el SV separado y mueva los fórceps más hacia el extremo apical de la pared lateral, separando el SV como una cinta larga si es posible (Figura 2I). No apriete el SV con fórceps para tirar de él. Si el tejido es demasiado frágil para ser agarrado, alternativamente se puede recolectar usando una cuchara de pañuelo, como una cureta de chalazión. NOTA: El movimiento del SV siempre debe hacerse bajo microscopía óptica para asegurarse de que no se pierda. Siempre tenga cuidado al agarrar con fórceps debido al riesgo de daño. Los usuarios pueden encontrar que el uso de la cureta chalazion mitiga el riesgo de daño al tejido SV. Para la secuenciación de un solo núcleo, continúe con la sección 5. Para la inmunotinción SV, continúe con la sección 7.</li>
</ol>5. SV suspensión mononúcleo
NOTA: Este protocolo está adaptado para el tejido SV específicamente a partir de un protocolo de suspensión de un solo núcleo publicado por el fabricante. Se pueden utilizar plataformas de diferentes fabricantes31. Dada la variación específica de la plataforma, se recomienda revisar el protocolo específico del fabricante proporcionado con el equipo. Para lograr resultados óptimos para sNuc-Seq y minimizar la degradación del ARN, cuanto más rápida sea la disección del tejido, mejor (recomendado dentro de los 15-20 minutos posteriores a la eutanasia). Puede ser útil sacrificar a un animal a la vez y solo cuando esté listo para diseccionar. Tener varias personas trabajando simultáneamente en las disecciones también puede eliminar el tiempo de degradación (por ejemplo, un personal de laboratorio trabajando en el oído izquierdo mientras otro trabaja en el oído derecho).
<ol><li>Si el tejido SV se va a utilizar para sNuc-Seq, coloque el tejido en tampón de lisis refrigerado (10 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 0,005% nonidet P40 en agua libre de nucleasa). NOTA: Si la secuenciación se va a realizar inmediatamente después de la disección, continúe con el protocolo. Si se desea pausar el protocolo, la preservación de SV es posible colocando el SV en RNAlater. Conservar durante la noche a 4 °C, luego congelar rápidamente en nitrógeno líquido y almacenar a -80 °C hasta que esté listo para usar. Cuando esté listo para usar, descongele y lave dos veces en PBS durante 5 minutos cada una, luego proceda con la homogeneización (paso 5.2).</li>
	<li>Homogeneizar el tejido en un homogeneizador de 2 mL con 10-20 golpes sobre hielo. NOTA: El cilindro de vidrio contactará manualmente con la parte inferior del tubo de vidrio, fragmentando el SV. El SV es delicado, por lo que 20 golpes generalmente logran una homogeneización exitosa.</li>
	<li>Lise el tejido en hielo durante 25 min. NOTA: El tiempo de lisis varía según el tipo de tejido. Una lisis de 25 min en el tejido SV puede lograr una viabilidad celular baja (menos del 4%), pero el tiempo puede adaptarse si la viabilidad celular es demasiado alta (paso 5.8).</li>
	<li>Filtrar a través de un filtro de 30 μm y girar el filtrado a 500 x g durante 5 min a 4 °C.</li>
	<li>Retire el sobrenadante y resuspenda el pellet celular en 1 ml de tampón de lavado y resuspensión de núcleos (1x PBS, albúmina sérica bovina al 1% [BSA], inhibidor de la RNasa 0.2U/μL).</li>
	<li>Filtrar las células a través de un filtro de 10 μm y centrifugar a 500 x g durante 5 min a 4 °C.</li>
	<li>Retirar el sobrenadante y resuspender en 50 μL de núcleos de lavado y tampón de resuspensión.</li>
	<li>Cuente los núcleos usando un contador de células y tinción de azul de tripano. Diluir 5 μL de la suspensión celular en 50 μL de 1x PBS para el recuento celular; La viabilidad debe ser mínima (3%-4%) en este punto. Si se encuentra que la viabilidad es mayor, adapte el protocolo para el paso 5.3 (lisis) y estandarice el tiempo de lisis para garantizar una lisis adecuada de las células. NOTA: Una alta viabilidad celular en una preparación de un solo núcleo significa que hay más células intactas de las deseadas, y que puede ser necesaria una digestión adicional.</li>
	<li>Cargue la muestra con la densidad nuclear deseada en el aparato/chip del fabricante (consulte la guía del fabricante). Las capturas de núcleos únicos ya están listas. NOTA: A partir de un SV de ratón adulto, generalmente se alcanzan 50 μL de la suspensión a una concentración de 150,000 núcleos / ml.</li>
</ol>6. Secuenciación de un solo núcleo SV
<ol><li>Envíe las muestras a la instalación central para su secuenciación. NOTA: Esta parte del protocolo sigue los pasos generales de (1) generación de perlas de gel en emulsión (GEM) y código de barras, (2) limpieza post-GEM-RT y amplificación de ADNc, y (3) construcción de la biblioteca de expresión génica 3'. El resto del protocolo sNuc-Seq es relativamente largo, y se recomienda que los lectores utilicen su protocolo específico del fabricante. La guía del fabricante probablemente describirá los pasos con detalles específicos e imágenes adjuntas. También puede haber videos de "cómo hacer" en el sitio web del fabricante. Los conjuntos de datos generados pueden representarse de manera dimensional reducida, como una aproximación y proyección de variedad uniforme (UMAP; Figura 3). Muchos laboratorios utilizan un núcleo de secuenciación que puede realizar este protocolo para los usuarios.</li>
</ol>7. Inmunotinción SV y montaje de tejidos
<ol><li>Si el tejido se va a utilizar para inmunotinción, transfiéralo a una placa de 24 pocillos, sumérjalo en 200 μL de paraformaldehído al 4% (PFA) en 1x PBS, e incubar durante 20 min a temperatura ambiente. NOTA: Es útil realizar toda la eliminación de líquidos, lavado e inmunotinción bajo un microscopio. La visualización durante el pipeteo del tejido asegurará que no se pierda accidentalmente durante la eliminación del líquido. Los volúmenes de los anticuerpos y lavados pueden ajustarse siempre que el volumen sea lo suficientemente grande como para sumergir el tejido SV dentro de la solución.</li>
	<li>Después de la etapa de fijación, retire el PFA realizando dos lavados cortos en 1x PBS (aproximadamente 500 μL) a 4 °C durante 5 min cada uno en un agitador orbital a bajas (30-50) RPM. Si se almacena, el tejido se puede almacenar en 1x PBS a 4 °C.</li>
	<li>Retirar el PBS y permeabilizar y bloquear durante un mínimo de 1 h a temperatura ambiente en aproximadamente 300 μL de solución de PBS-T (0,05 Tween20 en 1x PBS con 10% de suero fetal bovino). NOTA: Los anticuerpos primarios y secundarios deben diluirse en esta solución bloqueante.</li>
	<li>Teñir el tejido con anticuerpos primarios de acuerdo con las especificaciones del anticuerpo particular utilizado, generalmente durante la noche a 4 °C. Retire el PBS restante y agregue el anticuerpo primario diluido. NOTA: La dilución debe elegirse en función de las sugerencias del fabricante, los datos publicados, la experiencia previa, etc. Por lo general, la primera concentración a probar es una dilución 1: 100-200. Para el ejemplo presentado en este documento, los anticuerpos GS-IB4 y DAPI se diluyeron cada uno a 1:200. Si se tinciona para más de una proteína, se pueden combinar múltiples anticuerpos primarios en la misma solución, siempre y cuando cada anticuerpo primario tenga un huésped diferente para evitar la reactividad cruzada de anticuerpos secundarios.</li>
	<li>Lave el anticuerpo primario del tejido usando aproximadamente 500 μL de 1x PBS dos veces durante 10 minutos cada una en un agitador orbital a bajas RPM. NOTA: Continúe asegurándose de que el tejido SV esté sumergido en la solución y no atascado en el lado del pozo.</li>
	<li>Tinción con un anticuerpo secundario de acuerdo con las especificaciones del anticuerpo particular utilizado, generalmente durante 2 h a temperatura ambiente en un agitador orbital a bajas RPM. Cubra la placa de 24 pocillos para que el anticuerpo secundario marcado con fluorescencia esté protegido de la luz. NOTA: Si se necesita más de un anticuerpo secundario, combine los anticuerpos secundarios en la misma solución. Asegúrese de evitar el etiquetado cruzado.</li>
	<li>Lave el anticuerpo secundario del tejido usando aproximadamente 500 μL de 1x PBS cuatro veces durante 5 minutos cada una en un agitador orbital a bajas RPM. Mantenga la placa de 24 pocillos cubierta para protegerla de la luz.</li>
	<li>Prepare el microportaobjetos más grande (75 mm x 25 mm) colocando dos pequeñas vetas de pegamento a lo largo del eje de 25 mm, un poco más pequeño que el cubreobjetos de vidrio más pequeño de 18 mm x 18 mm. Coloque una gota de reactivo de montaje (aproximadamente 50 μL) entre las rayas de pegamento. NOTA: El pegamento crea una pequeña cantidad de espacio vertical para que cuando el segundo cubreobjetos se coloque en la parte superior, la muestra de tejido SV pueda existir de manera segura, pero continúe en su lugar. Si bien el grosor de la estría es de 30-40 micras, se debe evitar apretar el tejido entre las superficies de vidrio para preservar la morfología. Alternativamente, también se puede usar cinta transparente.</li>
	<li>Usando pinzas #55, agarre la menor cantidad de tejido posible en un extremo del SV y transfiéralo desde el PBS a la gota del reactivo de montaje en el microportaobjetos más grande (75 mm x 25 mm). Coloque un extremo de un cubreobjetos de vidrio más pequeño (18 mm x 18 mm) en la corredera donde se colocó una raya de pegamento y suéltela suavemente para evitar crear burbujas de aire. El cubreobjetos caerá a la otra raya de pegamento y cubrirá el tejido SV.</li>
	<li>Selle el soporte frotando una gota de esmalte de uñas transparente en cada esquina del soporte. Etiquete la muestra en consecuencia en el cubreobjetos de vidrio lejos del campo de visualización. Ahora está listo para microscopía confocal (Figura 4).</li>
	<li>Visualice el tejido SV con un microscopio de disección para asegurarse de que esté plano y no cerca de ninguna burbuja de aire. Si el tejido SV no está orientado correctamente, el usuario puede intentar expulsar las burbujas de aire o quitar cuidadosamente el cubreobjetos de vidrio más pequeño y reposicionar el SV. Esto debe hacerse suavemente para evitar romper los cubreobjetos de vidrio.</li>
</ol>

Microdisección de estrías vasculares para secuenciación de un solo núcleo o inmunotinción

<ol>
	<li>Bosher, S. K., Warren, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observations+on+the+electrochemistry+of+the+cochlear+endolymph+of+the+rat:+a+quantitative+study+of+its+electrical+potential+and+ionic+composition+as+determined+by+means+of+flame+spectrophotometry.">Observations on the electrochemistry of the cochlear endolymph of the rat: a quantitative study of its electrical potential and ionic composition as determined by means of flame spectrophotometry.</a> Proceedings of the Royal Society of London. Series B. Biological Sciences. 171 (1023), 227-247 (1968).</li><li>Patuzzi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+flow+in+stria+vascularis+and+the+production+and+regulation+of+cochlear+endolymph+and+the+endolymphatic+potential.">Ion flow in stria vascularis and the production and regulation of cochlear endolymph and the endolymphatic potential.</a> Hearing Research. 277 (1-2), 4-19 (2011).</li><li>Wangemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=K++cycling+and+the+endocochlear+potential.">K+ cycling and the endocochlear potential.</a> Hearing Research. 165 (1-2), 1-9 (2002).</li><li>Adachi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+underlying+maintenance+of+the+endocochlear+potential+by+the+K++transport+system+in+fibrocytes+of+the+inner+ear.">The mechanism underlying maintenance of the endocochlear potential by the K+ transport system in fibrocytes of the inner ear.</a> The Journal of Physiology. 591 (18), 4459-4472 (2013).</li><li>Hibino, H., Nin, F., Tsuzuki, C., Kurachi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+is+the+highly+positive+endocochlear+potential+formed?+The+specific+architecture+of+the+stria+vascularis+and+the+roles+of+the+ion-transport+apparatus.">How is the highly positive endocochlear potential formed? The specific architecture of the stria vascularis and the roles of the ion-transport apparatus.</a> Pflugers Archiv. 459 (4), 521-533 (2010).</li><li>Lang, F., Vallon, V., Knipper, M., Wangemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+significance+of+channels+and+transporters+expressed+in+the+inner+ear+and+kidney.">Functional significance of channels and transporters expressed in the inner ear and kidney.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 293 (4), C1187-C1208 (2007).</li><li>Liu, W., Schrott-Fischer, A., Glueckert, R., Benav, H., Rask-Andersen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+&amp;#34;cochlear+battery&amp;#34;-claudin-11+barrier+and+ion+transport+proteins+in+the+lateral+wall+of+the+cochlea.">The human &amp;#34;cochlear battery&amp;#34;-claudin-11 barrier and ion transport proteins in the lateral wall of the cochlea.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 239 (2017).</li><li>Marcus, D. C., Wu, T., Wangemann, P., Kofuji, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KCNJ10+(Kir4.1)+potassium+channel+knockout+abolishes+endocochlear+potential.">KCNJ10 (Kir4.1) potassium channel knockout abolishes endocochlear potential.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 282 (2), C403-C407 (2002).</li><li>Spicer, S. S., Schulte, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+inner+ear+fibrocytes+according+to+their+ion+transport+related+activity.">Differentiation of inner ear fibrocytes according to their ion transport related activity.</a> Hearing Research. 56 (1-2), 53-64 (1991).</li><li>Wangemann, P., Liu, J., Marcus, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+transport+mechanisms+responsible+for+K++secretion+and+the+transepithelial+voltage+across+marginal+cells+of+stria+vascularis+in+vitro.">Ion transport mechanisms responsible for K+ secretion and the transepithelial voltage across marginal cells of stria vascularis in vitro.</a> Hearing Research. 84 (1-2), 19-29 (1995).</li><li>Yoshida, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unique+ion+permeability+profile+of+cochlear+fibrocytes+and+its+contribution+to+establishing+their+positive+resting+membrane+potential.">The unique ion permeability profile of cochlear fibrocytes and its contribution to establishing their positive resting membrane potential.</a> Pflugers Archiv. 468 (9), 1609-1619 (2016).</li><li>Johns, J. D., Adadey, S. M., Hoa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+stria+vascularis+in+neglected+otologic+disease.">The role of the stria vascularis in neglected otologic disease.</a> Hearing Research. 428, 108682 (2023).</li><li>Kim, J., Ricci, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+real-time+imaging+reveals+megalin+as+the+aminoglycoside+gentamicin+transporter+into+cochlea+whose+inhibition+is+otoprotective.">In vivo real-time imaging reveals megalin as the aminoglycoside gentamicin transporter into cochlea whose inhibition is otoprotective.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (9), e2117846119 (2022).</li><li>Zdebik, A. A., Wangemann, P., Jentsch, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potassium+ion+movement+in+the+inner+ear:+insights+from+genetic+disease+and+mouse+models.">Potassium ion movement in the inner ear: insights from genetic disease and mouse models.</a> Physiology. 24, 307-316 (2009).</li><li>Chen, J., Zhao, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+an+inwardly+rectifying+K++channel+(Kir4.1)+in+the+inner+ear+and+hearing+loss.">The role of an inwardly rectifying K+ channel (Kir4.1) in the inner ear and hearing loss.</a> Neuroscience. 265, 137-146 (2014).</li><li>Steel, K. P., Barkway, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Another+role+for+melanocytes:+their+importance+for+normal+stria+vascularis+development+in+the+mammalian+inner+ear.">Another role for melanocytes: their importance for normal stria vascularis development in the mammalian inner ear.</a> Development. 107 (3), 453-463 (1989).</li><li>Ito, T., Nishio, A., Wangemann, P., Griffith, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+irreversible+hearing+loss+is+caused+by+stria+vascularis+degeneration+in+an+Slc26a4-insufficient+mouse+model+of+large+vestibular+aqueduct+syndrome.">Progressive irreversible hearing loss is caused by stria vascularis degeneration in an Slc26a4-insufficient mouse model of large vestibular aqueduct syndrome.</a> Neuroscience. 310, 188-197 (2015).</li><li>Gu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+rare+spindle+and+root+cell+transcriptional+profiles+in+the+stria+vascularis+of+the+adult+mouse+cochlea.">Characterization of rare spindle and root cell transcriptional profiles in the stria vascularis of the adult mouse cochlea.</a> Scientific Reports. 10 (1), 18100 (2020).</li><li>Gow, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deafness+in+claudin+11-null+mice+reveals+the+critical+contribution+of+basal+cell+tight+junctions+to+stria+vascularis+function.">Deafness in claudin 11-null mice reveals the critical contribution of basal cell tight junctions to stria vascularis function.</a> The Journal of Neuroscience. 24 (32), 7051-7062 (2004).</li><li>Chang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virally+mediated+Kcnq1+gene+replacement+therapy+in+the+immature+scala+media+restores+hearing+in+a+mouse+model+of+human+Jervell+and+Lange-Nielsen+deafness+syndrome.">Virally mediated Kcnq1 gene replacement therapy in the immature scala media restores hearing in a mouse model of human Jervell and Lange-Nielsen deafness syndrome.</a> EMBO Molecular Medicine. 7 (8), 1077-1086 (2015).</li><li>Faridi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutational+and+phenotypic+spectra+of+KCNE1+deficiency+in+Jervell+and+Lange-Nielsen+Syndrome+and+Romano-Ward+Syndrome.">Mutational and phenotypic spectra of KCNE1 deficiency in Jervell and Lange-Nielsen Syndrome and Romano-Ward Syndrome.</a> Human Mutation. 40 (2), 162-176 (2019).</li><li>Wangemann, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+KCNJ10+protein+expression+abolishes+endocochlear+potential+and+causes+deafness+in+Pendred+syndrome+mouse+model.">Loss of KCNJ10 protein expression abolishes endocochlear potential and causes deafness in Pendred syndrome mouse model.</a> BMC Medicine. 2, 30 (2004).</li><li>Kitajiri, S. -. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+patterns+of+claudins,+tight+junction+adhesion+molecules,+in+the+inner+ear.">Expression patterns of claudins, tight junction adhesion molecules, in the inner ear.</a> Hearing Research. 187 (1-2), 25-34 (2004).</li><li>Jagger, D. J., Nevill, G., Forge, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+membrane+properties+of+cochlear+root+cells+are+consistent+with+roles+in+potassium+recirculation+and+spatial+buffering.">The membrane properties of cochlear root cells are consistent with roles in potassium recirculation and spatial buffering.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 11 (3), 435-448 (2010).</li><li>Ito, T., Kurata, N., Fukunaga, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+macrophages+in+the+stria+vascularis.">Tissue-resident macrophages in the stria vascularis.</a> Frontiers in Neurology. 13, 818395 (2022).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGFA165+gene+therapy+ameliorates+blood-labyrinth+barrier+breakdown+and+hearing+loss.">VEGFA165 gene therapy ameliorates blood-labyrinth barrier breakdown and hearing loss.</a> JCI Insight. 6 (8), e143285 (2021).</li><li>Shi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+the+cochlear+intrastrial+fluid-blood+barrier+(review).">Pathophysiology of the cochlear intrastrial fluid-blood barrier (review).</a> Hearing Research. 338, 52-63 (2016).</li><li>Gu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+potential+Meniere's+disease+targets+in+the+adult+stria+vascularis.">Identification of potential Meniere's disease targets in the adult stria vascularis.</a> Frontiers in Neurology. 12, 630561 (2021).</li><li>Fischer, J., Ayers, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+nucleus+RNA-sequencing:+how+it's+done,+applications+and+limitations.">Single nucleus RNA-sequencing: how it's done, applications and limitations.</a> Emerging Topics in Life Sciences. 5 (5), 687-690 (2021).</li><li>Korrapati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+and+single+nucleus+RNA-Seq+reveal+cellular+heterogeneity+and+homeostatic+regulatory+networks+in+adult+mouse+stria+vascularis.">Single cell and single nucleus RNA-Seq reveal cellular heterogeneity and homeostatic regulatory networks in adult mouse stria vascularis.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, 316 (2019).</li><li>Pyle, M. P., Hoa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+single-cell+sequencing+for+the+field+of+otolaryngology:+A+contemporary+review.">Applications of single-cell sequencing for the field of otolaryngology: A contemporary review.</a> Laryngoscope Investigative Otolaryngology. 5 (3), 404-431 (2020).</li><li>Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+technologies+and+bioinformatics+pipelines.">Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines.</a> Experimental &amp; Molecular Medicine. 50 (8), 1-14 (2018).</li><li>Shafer, M. E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-species+analysis+of+single-cell+transcriptomic+data.">Cross-species analysis of single-cell transcriptomic data.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 175 (2019).</li><li>Chen, G., Ning, B., Shi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA-Seq+technologies+and+related+computational+data+analysis.">Single-cell RNA-Seq technologies and related computational data analysis.</a> Frontiers in Genetics. 10, 317 (2019).</li><li>Longo, S. K., Guo, M. G., Ji, A. L., Khavari, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+single-cell+and+spatial+transcriptomics+to+elucidate+intercellular+tissue+dynamics.">Integrating single-cell and spatial transcriptomics to elucidate intercellular tissue dynamics.</a> Nature Reviews Genetics. 22 (10), 627-644 (2021).</li><li>Kim, N., Kang, H., Jo, A., Yoo, S. A., Lee, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspectives+on+single-nucleus+RNA+sequencing+in+different+cell+types+and+tissues.">Perspectives on single-nucleus RNA sequencing in different cell types and tissues.</a> Journal of Pathology and Translational Medicine. 57 (1), 52-59 (2023).</li><li>Grindberg, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-sequencing+from+single+nuclei.">RNA-sequencing from single nuclei.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (49), 19802-19807 (2013).</li><li>Montgomery, S. C., Cox, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+dissection+and+immunofluorescence+of+the+adult+mouse+cochlea.">Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea.</a> Journal of Visuazlied Experiments. (107), e53561 (2016).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Antes del advenimiento de la secuenciación de células individuales, muchos investigadores utilizaron el análisis de tejido a granel, que solo hizo posible analizar transcriptomas promediados en las células. En particular, la célula única y sNuc-Seq permitieron aislar el transcriptoma de una sola célula o de un solo núcleo, respectivamente32. En este caso, se pueden identificar transcriptomas de un solo núcleo para células marginales, intermedias y basales, así como para células fusifor...

La cóclea consiste en tres cámaras llenas de líquido, la scala vestibuli, la scala media y la scala tympani. La scala vestibuli y la scala tympani contienen perilinfa, que tiene una alta concentración de sodio (138 mM) y una baja concentración de potasio (6,8 mM)1. La escala media contiene endolinfa, que tiene una alta concentración de potasio (154 mM) y una baja concentración de sodio (0,91 mM)1,2,3. Esta diferencia en la concentración de iones puede denominarse potencial endococlear (EP), y se genera principalmente por el movimiento de iones de potasio a través de varios canales iónicos y uniones de brecha en la estría vascular (SV) a lo largo de la pared lateral de la cóclea 4,5,6,7,8,9,10,11 . El SV es un tejido heterogéneo, altamente vascularizado, que recubre la cara medial de la pared lateral de la cóclea y contiene tres tipos principales de células: células marginales, intermedias y basales12 (Figura 1).
Las células marginales están conectadas por uniones estrechas para formar la superficie más medial del SV. La membrana apical se enfrenta a la endolinfa de la escala media y contribuye al transporte de iones de potasio en la endolinfa utilizando varios canales, incluyendo KCNE1/KCNQ1, SLC12A2 y Na+-K+-ATPasa (NKA)5,10,13,14. Las células intermedias son células pigmentadas que residen entre las células marginales y basales y facilitan el transporte de potasio a través del SV utilizando KCNJ10 (Kir 4.1)15,16. Las células basales se encuentran muy cerca de la pared lateral de la cóclea y están estrechamente asociadas con los fibrocitos del ligamento espiral para promover el reciclaje de potasio de la perilinfa12. La patología de la SV ha sido implicada en numerosos trastornos otológicos17,18. Las mutaciones en los genes expresados en los principales tipos de células SV, como Kcnq1, Kcne1, Kcnj10 y Cldn11, pueden causar sordera y disfunción de SV, incluida la pérdida de EP 19,20,21,22,23. Además de los tres tipos principales de células, hay otros tipos de células menos estudiadas en el SV, como las células fusiformes 22, las células raíz12,24, los macrófagos 25, los pericitos 26 y las células endoteliales 27, que tienen funciones incompletamente definidas que involucran la homeostasis iónica y la generación de EP 28.
En comparación con la secuenciación masiva de ARN, la secuenciación de ARN de núcleos únicos (sNuc-Seq) proporciona información sobre la heterogeneidad celular, en lugar de un promedio de ARNm en un grupo de células29, y puede ser particularmente útil cuando se estudia el SV30 heterogéneo. Por ejemplo, sNuc-Seq ha producido un análisis transcripcional que sugiere que puede haber un papel para las células fusiformes y radiculares en la generación de EP, la pérdida de audición y la enfermedad de Meniere18. La caracterización transcripcional adicional de los diversos tipos de células SV puede proporcionarnos información invaluable sobre la fisiopatología subyacente a los diferentes mecanismos y subtipos de fluctuación auditiva relacionada con SV y pérdida auditiva. La cosecha de estas delicadas estructuras del oído interno es de suma importancia para el análisis óptimo del tejido.
En este estudio, se describe el enfoque de microdisección para acceder y aislar la estría vascular de la cóclea de ratón adulta para sNuc-Seq o inmunotinción. La disección del SV del ratón adulto es necesaria para comprender varios tipos de células SV y caracterizar aún más su papel en la audición.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >10-&#181;m filter (Polyethylenterephthalat)</td>
			<td >PluriSelect</td>
			<td >#43-50010-01</td>
			<td >Filter tissue during sNuc-Seq</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >18 x 18 mm cover glass</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >12-541A</td>
			<td >Cover slip to mount SV</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >30-&#181;m filter (Polyethylenterephthalat)</td>
			<td >PluriSelect</td>
			<td >#43-50030-03</td>
			<td >Filter tissue during sNuc-Seq</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >75 x 25 mm Superfrost Plus/Colorforst Plus Microslide</td>
			<td >Daigger</td>
			<td >EF15978Z</td>
			<td >Microslide to mount SV on</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >C57BL/6J Mice</td>
			<td >The Jackson Laboratory</td>
			<td >RRID: IMSR_JAX:000664</td>
			<td >General purpose mouse strain that has pigment more easily seen in the intermediate cells of the SV.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Counter</td>
			<td >Logos Biosystems</td>
			<td >L20001</td>
			<td >Used for cell counting</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chalizon curette 5&#39;&#39;, size 3 2.5 mm</td>
			<td >Biomedical Research Instruments</td>
			<td >15-1020</td>
			<td >Used to transfer SV</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chromium Next GEM single Cell 3&#39; GEM Kit v3.1</td>
			<td >Chromium</td>
			<td >PN-1000141</td>
			<td >Generates single cell 3&#39; gene expression libraries</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear nail polish</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >NC1849418</td>
			<td >Used for sealing SV mount</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Corning Falcon Standard Tissue Culture Dishes, 24 well</td>
			<td >Corning</td>
			<td >08-772B</td>
			<td >Culture dish used to hold specimen during dissection</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DAPI</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >D1306, RRID: AB_2629482</td>
			<td >Stain used for nucleus labeling</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dounce homogenizer</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >D8938</td>
			<td >Used to homogenize tissue for sNuc-seq</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dumont #5 Forceps</td>
			<td >Fine Science Tools</td>
			<td >11252-30</td>
			<td >General forceps for dissection</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dumont #55 Forceps</td>
			<td >Fine Science Tools</td>
			<td >11255-20</td>
			<td >Forceps with fine tip that makes SV manipulation easier</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Bovine Serum</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >16000044</td>
			<td >Used for steps of sNuc-Seq</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glue stick</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >NC0691392</td>
			<td >Used for mounting SV</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GS-IB4 Antibody</td>
			<td >Molecular Probes</td>
			<td >I21411, RRID: AB-2314662</td>
			<td >Antibody used for capillary labeling</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >KCNJ10-ZsGreen Mice</td>
			<td >n/a</td>
			<td >n/a</td>
			<td >Transgenic mouse that expresses KCNJ10-ZsGreen, partiularly in the intermediate cells of the SV.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MgCl2</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >AM9530G</td>
			<td >Used for steps of sNuc-Seq</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mounting reagent</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >#S36940</td>
			<td >Mounting reagent for SV</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Multiwell 24 well plate</td>
			<td >Corning</td>
			<td >#353047</td>
			<td >Plate used for immunostaining</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >NaCl</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >AAJ216183</td>
			<td >Used for steps of sNuc-Seq</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nonidet P40</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >9-16-45-9</td>
			<td >Used for steps of sNuc-Seq</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nuclease free water</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >4387936</td>
			<td >Used for steps of sNuc-Seq</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Orbital shaker</td>
			<td >Silent Shake</td>
			<td >SYC-2102A</td>
			<td >Used for steps of immunostaining</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PBS</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >J61196.AP</td>
			<td >Used for steps of immunostaining and dissection</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RNA Later</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >AM7021</td>
			<td >Used for preservation of SV for sNuc-Seq</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Scizzors</td>
			<td >Fine Science Tools</td>
			<td >14058-09</td>
			<td >Used for splitting mouse skull</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tris-HCl</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >15506017</td>
			<td >Used for steps of sNuc-Seq</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypan blue stain</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >15250061</td>
			<td >Used for cell counting</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tween20</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >AAJ20605AP&#160;</td>
			<td >Used for steps of sNuc-Seq</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Zeiss STEMI SV 11 Apo stereomicroscope</td>
			<td >Zeiss</td>
			<td >n/a</td>
			<td >Microscope used for dissections</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection of adult mouse stria vascularis for single-nucleus sequencing or immunostaining

El potencial endococlear, que es generado por la estría vascular, es esencial para mantener un entorno propicio para la mecanotransducción adecuada de las células ciliadas y, en última instancia, la audición. Las patologías de la estría vascular pueden resultar en una disminución de la audición. La disección de la estría vascular adulta permite la captura focalizada de un solo núcleo y la posterior secuenciación e inmunotinción de un solo núcleo. Estas técnicas se utilizan para estudiar la fisiopatología de la estría vascular a nivel unicelular. 
La secuenciación de un solo núcleo se puede utilizar en el contexto del análisis transcripcional de la estría vascular. Mientras tanto, la inmunotinción sigue siendo útil para identificar poblaciones específicas de células. Ambos métodos requieren una disección adecuada de la estría vascular como requisito previo, lo que puede resultar técnicamente desafiante.

The cochlea consists of three fluid filled chambers, the scala vestibuli, scala media, and scala tympani. The scala vestibuli and scala tympani each contain perilymph, which has a high concentration of sodium (138 mM) and a low concentration of potassium (6.8 mM)1. The scala media contains endolymph, which has a high concentration of potassium (154 mM) and a low concentration of sodium (0.91 mM)1,2,3. This difference in ion concentration can be referred to as the endocochlear potential (EP), and is primarily generated by the movement of potassium ions through various ion channels and gap junctions in the stria vascularis (SV) along the lateral wall of the cochlea4,5,6,7,8,9,10,11. The SV is a heterogenous, highly vascularized tissue that lines the medial aspect of the lateral wall of the cochlea and contains three main cell types: marginal, intermediate, and basal cells12 (Figure 1).
Marginal cells are connected by tight junctions to form the most medial surface of the SV. The apical membrane faces the endolymph of the scala media and contributes to potassium ion transport into the endolymph using various channels, including KCNE1/KCNQ1, SLC12A2, and Na+-K+-ATPase (NKA)5,10,13,14. Intermediate cells are pigmented cells that reside between marginal and basal cells and facilitate potassium transport through the SV using KCNJ10 (Kir 4.1)15,16. Basal cells lie in close proximity to the lateral wall of the cochlea and are closely associated with fibrocytes of the spiral ligament to promote potassium recycling from the perilymph12. Pathology of the SV has been implicated in numerous otologic disorders17,18. Mutations in genes expressed in the major SV cell types, such as Kcnq1, Kcne1, Kcnj10, and Cldn11, can cause deafness and SV dysfunction, including the loss of EP19,20,21,22,23. In addition to the three major cell types, there are other less-studied cell types in the SV, such as spindle cells22, root cells12,24, macrophages25, pericytes26, and endothelial cells27, that have incompletely defined roles involving ionic homeostasis and the generation of EP28.
In comparison to bulk RNA-sequencing, single-nuclei RNA-sequencing (sNuc-Seq) provides information about cell heterogeneity, rather than an average of mRNA across a group of cells29, and can be particularly useful when studying the heterogenous SV30. For example, sNuc-Seq has produced transcriptional analysis that suggests there may be a role for spindle and root cells in EP generation, hearing loss, and Meniere&#39;s disease18. Further transcriptional characterization of the various SV cell types can provide us with invaluable information on the pathophysiology underlying different mechanisms and subtypes of SV-related hearing fluctuation and hearing loss. The harvest of these delicate inner ear structures is of paramount importance to optimal tissue analysis.
In this study, the microdissection approach to access and isolate the stria vascularis from the adult mouse cochlea for sNuc-Seq or immunostaining is described. Dissection of the adult mouse SV is required to understand various SV cell types and further characterize their role in hearing.

Autor destacado: Disección de estrias vasculares de ratones adultos para secuenciación de un solo núcleo o inmunotinción  

Disección de estrías vasculares de ratón adulto para secuenciación de un solo núcleo o inmunotinción

The stria vascularis functions to generate the endocochlear potential and regulate ion homeostasis in the cochlea. The auditory development and restoration program seeks to understand the underlying mechanisms connecting dysfunctional ion homeostasis with hearing and stability disorders, which are diseases where either fluctuation in or sudden hearing loss occurs. Work in my lab has established the transcriptional landscape of the stria vascularis and has contributed to our understanding of its importance in hearing.We have used these data to draw parallels to poorly-understood hearing and stability disorders, including Meniere's disease. This protocol enables the dissection and isolation of whole-mount stria vascularis for further molecular studies including immunohistochemistry. Given that stria vascularis cell types are intricately intertwined with one another, the use of nuclear isolation and single-nucleus RNA sequencing has facilitated our understanding of the distinct transcriptional machinery involved.

Presentamos un método para aislar el SV que se utilizará para sNuc-Seq o inmunotinción. La anatomía relevante (Figura 1) de la cóclea en relación con la SV puede ayudar a los usuarios a comprender mejor la organización de la SV y los pasos del protocolo de disección.
Cada paso de esta microdisección de SV desde un mouse P30 se detalla en el video asociado, y las instantáneas de los pasos clave de esta disección y aislamiento de SV se presentan en la <st...

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La estría vascular es vital para la generación de potencial endococlear. Aquí, presentamos la disección de la estría vascular del ratón adulto para la secuenciación de un solo núcleo o inmunotinción.

Endocochlear potential, which is generated by the stria vascularis, is essential to maintain an environment conducive to appropriate hair cell ...

La estría vascular funciona para generar el potencial endococlear y regular la homeostasis iónica en la cóclea. El programa de desarrollo y restauración auditiva busca comprender los mecanismos subyacentes que conectan la homeostasis de iones disfuncionales con los trastornos auditivos y de estabilidad, que son enfermedades en las que se produce fluctuación o pérdida auditiva repentina. El trabajo en mi laboratorio ha establecido el paisaje transcripcional de la estría vascular y ha contribuido a nuestra comprensión de su importancia en la audición.Hemos utilizado estos datos para establecer paralelismos con trastornos auditivos y de estabilidad poco conocidos, incluida la enfermedad de Meniere. Este protocolo permite la disección y el aislamiento de la estría vascular de montaje completo para estudios moleculares adicionales, incluida la inmunohistoquímica. Dado que los tipos de células de estría vascular están intrincadamente entrelazadas entre sí, el uso del aislamiento nuclear y la secuenciación de ARN de un solo núcleo ha facilitado nuestra comprensión de la distinta maquinaria transcripcional involucrada.

dissection-adult-mouse-stria-vascularis-for-single-nucleus-sequencing

Research

JoVE Journal

Biology

Dissection of Adult Mouse Stria Vascularis for Single-Nucleus Sequencing or Immunostaining

1.3K vistas.  National Institutes of Health. La estría vascular funciona para generar el potencial endococlear y regular la homeostasis iónica en la cóclea. El programa de desarrollo y restauración auditiva busca comprender los mecanismos subyacentes que conectan la homeostasis de iones disfuncionales con los trastornos auditivos y de estabilidad, que son enfermedades en las que se produce fluctuación o pérdida auditiva repentina. El trabajo en mi laboratorio ha establecido el paisaje transcripcional de la estría vascular y ha co...

Video: Autor destacado: Disección de estrias vasculares de ratones adultos para secuenciación de un solo núcleo o inmunotinción  

Endocochlear potential, which is generated by the stria vascularis, is essential to maintain an environment conducive to appropriate hair cell mechanotransduction and ultimately hearing. Pathologies of the stria vascularis can result in a decreased hearing. Dissection of the adult stria vascularis allows for focused single-nucleus capture and subsequent single-nucleus sequencing and immunostaining. These techniques are used to study stria vascularis pathophysiology at the single-cell level. 
Single-nucleus sequencing can be used in the setting of transcriptional analysis of the stria vascularis. Meanwhile, immunostaining continues to be useful in identifying specific populations of cells. Both methods require proper stria vascularis dissection as a prerequisite, which can prove to be technically challenging.

The stria vascularis is vital to the generation of endocochlear potential. Here, we present the dissection of the adult mouse stria vascularis for single-nucleus sequencing or immunostaining.

Investigación

Biología

Mouse Inner Ear Extraction and Stria Vascularis Dissection

To begin, identify the inner ear within the temporal bone of a euthanized mouse. Scrape away the cranial nerves using number 55 forceps. Then use number 55 forceps to dissect out the bulla and capsule, detaching them from surrounding bone.Remove any remaining soft tissue from the inner ear surface. For SV dissection, use number 55 forceps to hold the specimen by the vestibular portion with the cochlear facing up. Pierce through the cochlear bone at the apex using the same forceps.Scrape along the apical turn, applying gentle force to break away small pieces of the outer bone layer. Gently lift the bone and detach it from the lateral wall. Using number 55 forceps remove cochlear bone pieces from the apical and middle turns.Gently pushing down the lateral wall, pry and remove the bone wall pieces towards the middle turn to expose the lateral wall of the apical and middle turns. Push the apical turn lateral wall aside to expose the spiral ganglion. Detach the lateral wall of the apical and middle turns from the spiral ganglion along the outer hair cell layer.Then remove pieces of spiral ganglion from inside the cochlear. Detach the cochlear from the vestibular portion of the temporal bone by inserting the forceps into the round and oval window and pushing down towards the vestibule to have better access to the lateral wall of the basal turn. After the cochlear is detached remove the vestibular portion of the inner ear.Prioritize preserving as much of the strayer as possible. Continue removing til the bone of the middle turn is detached from the SV.Next, remove pieces of the remaining cochlear bone covering the basal turn. This can be accomplished by pushing the lateral wall layer under the bone to detach it.Pry and gently pull the tissue to remove the farthest basal part of the lateral wall being careful not to damage the soft tissue below. With the basal part of the lateral wall detached, separate the lateral wall from the remaining cochlear by tracing the forceps along the lateral wall. Gently brush the forceps between the bone and the remaining lateral wall until it reaches the apex.Then move the lateral wall to a fresh PBS. Lay the lateral wall flat revealing the SV as a darker layer of tissue on the internal side of the lateral wall. Gently pry the SV layer away from the lateral wall.Push aside the detached SV and advance the forceps along the lateral wall attempting to detach the SV as one long ribbon, trying not to squeeze the SV.Use a tissue scoop to collect the fragile tissue. Cochlear were dissected from adult mouse aged greater than or equal to postnatal day 30. Inner ear was extracted from the surrounding temporal bone.SV was exposed after the removal of bone covering the middle turn. The SV was fully separated from the lateral wall after dissection.

Extracción del oído interno del ratón y disección de estrías vasculares

Preparation of Stria Vascularis Single-Nucleus Suspension

Homogenize the dissected stria vascularis tissue from mouse ear in a two-milliliter Dounce homogenizer, with 10 to 20 strokes on ice. Lyse the tissue on ice for 25 minutes. Then, filter the tissue through a 30-micron filter and spin the filtrate at 500G for five minutes at four degrees Celsius.Remove the supernatant and resuspend the cell pellet in one milliliter of nuclei wash and resuspension buffer. Next, filter the cells through a 10-micron filter and centrifuge at 500G for five minutes at four degrees Celsius. Remove the supernatant and resuspend in 50 microliters of nuclei wash and resuspension buffer.After Trypan Blue staining, dilute five microliters of the cell suspension into 50 microliters of 1X PBS and count the cells. To prepare single nuclei captures, load the sample with the desired nuclear density onto the chip.

Preparación de Stria vascularis suspensión de un solo núcleo

Immunostaining of Mouse Stria Vascularis and Tissue Mounting

Prepare for immunostaining by dissecting the stria vascularis from the mouse and add the tissue to a 24-well plate containing 200 microliters of 4%paraformaldehyde in 1X PBS. Incubate the tissue for 20 minutes at room temperature. perform two short washes of 1X PBS on an orbital shaker at low RPM.Remove the PBS, then perform permeabilization and blocking for a minimum of one hour at room temperature in 300 microliters of PBST solution. Next, stain the tissue with the primary antibody overnight at four degrees Celsius. Then add a secondary antibody and incubate for two hours at room temperature on an orbital shaker at low RPM.Cover the plate to protect the fluorescently tagged secondary antibody from light. Next, prepare a larger microslide by placing two small streaks of glue along the 25 mm axis, just smaller than the 18 by 18 millimeter glass cover slip. Place one drop of mounting reagent between the glue streaks.Using number 55 forceps, gab as little tissue as possible on one end of the SV, and transfer it from PBS to the mounting reagent. Place one end of the cover slip on the slide where one streak of glue was placed. Then gently release the cover slip to avoid creating air bubbles.Seal the mount by dabbing a drop of transparent nail polish on each corner of the mount. Label the specimen on the glass cover slip, away from the visualization field. Visualize the SV tissue under a dissection microscope to ensure it is lying flat and not near any air bubbles.If the SV tissue is not oriented correctly, try to push out air bubbles or carefully remove the smaller glass cover slip and reposition the SV.A whole mount of SV from P30 mouse was prepared and confocal imaging was performed. ZsGreen expression was observed in the intermediate cells, GSIB4 labeled endothelial cells, and DAPI labeled the nuclei.