Los autores desean agradecer a Nicole M. Nemeth (Universidad de Georgia) y Jeanne M. Fair (LANL) por su ayuda en la recolección de tejidos de pollo, y Steven A. Springer por su ayuda durante el rodaje. El cuidado de las aves en este estudio fue de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud directrices para el uso humano de los animales de laboratorio y todos los protocolos fueron aprobados por el Cuidado de Animales institucional y el Comité de Uso de Los Alamos National Security, LLC, operador de Los Alamos Laboratorio Nacional bajo el Contrato No. DE-AC52-06NA25396 con el Departamento de Energía de EE.UU.. El cuidado de los ratones en este estudio está en conformidad con UCSD protocolo animal aprobado. Los tejidos humanos se obtuvieron como parte del protocolo de UCSD IRB aprobado. Este trabajo fue apoyado por la beca 118645 de la Universidad de California Cuota del Programa Laboratorio Presidente (PG) y NS047101 subvención del Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares (Fondo para Microscopía Neurociencia compartido, UC San Diego).

1. Tissue Embedding en octubre <ol><li> Prepare un baño de congelación mediante la adición de hielo seco para 2-metil butano en una caja de espuma de poliestireno superficial. </li><li> Se recoge el tejido, y suavemente húmedo en un pañuelo de papel para secar el exceso de líquido. Si se utiliza snap-congelado tejido (tejido que se congeló en nitrógeno líquido), permitir que el tejido se caliente a -20 ° C colocándolo en una cámara de crio-micrótomo. </li><li> Añadir una pequeña cantidad de octubre al molde Peel-A-Way congelación, lo suficiente para cubrir el fondo del molde. </li><li> Coloque el tejido en el molde, asegúrese de que el tejido se apoya sobre el fondo del molde en la orientación deseada. Una vez congelado, el bloque de tejido se seccionaron ya sea desde el fondo o desde los lados. </li><li> Cubrir el tejido con octubre, y colocar el molde en el baño de congelación. El compuesto octubre se volverá blanco como el tejido se congela. </li><li> Una vez congelado, pelar el molde del bloque congelado y colocar en una bolsa de congelación marcada. </li><li> Los bloques congelados se pueden mantenera -80 º C hasta su uso. </li></ol> 2. Tejido Seccionamiento <ol><li> Coloque bloques de tejido en la cámara criogénica micrótomo, y les permiten llegar a -20 º C (unos 30 minutos). </li><li> Cortar una sección gruesa 3-5 micras, y colocar un portaobjetos de vidrio cargado positivamente en la parte superior de la sección. El tejido se adhiere a la diapositiva. </li><li> Seque al aire los tejidos durante 30-60 min. </li><li> Los portaobjetos se pueden utilizar en esta etapa, o pueden ser mantenidas a -80 ° C para su uso futuro. </li></ol> 3. La tinción de tejidos <ol><li> Las diapositivas que fueron almacenadas a -80 ° C: deje que los portaobjetos para descongelar y secar al aire a temperatura ambiente durante 30 min. </li><li> Fijar los portas con 10% formalina tamponada durante 30 min a temperatura ambiente. </li><li> Se lava tres veces en PBS o tampón TBST, para cada lavado Sumergir los portaobjetos 10 veces en tampón de 250 ml. Tampón PBS se puede utilizar para la tinción de inmunofluorescencia, sin embargo, para la detección cromogénica con fosfatasa alcalina-ConjugATED anticuerpo, TBST debe ser usado ya que el fosfato en PBS inhibe la actividad de la fosfatasa alcalina. </li><li> Muestras de tejido se desliza ahora está listo para ser teñido. </li></ol> 4. Utilizando tinciones histoquímicas como Alcian Blue y ácido periódico de Schiff para detectar moco <ol><li> Alcian Blue mancha: <ol><li> Enjuagar los portaobjetos en agua, se incuba en 3% de ácido acético durante 3 min a temperatura ambiente. </li><li> Tiñen con Azul Alcian pH 2,5 solución durante 30 min a temperatura ambiente. </li><li> Lavar los portaobjetos en agua corriente del grifo durante 10 minutos, enjuague con agua DI. </li><li> Contrateñir en Fast Red nuclear durante 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Lavado de los portaobjetos tres veces en agua DI. </li></ol></li><li> Ácido periódico de Schiff mancha: <ol><li> Enjuagar los portaobjetos en agua, incubar en recién preparada 1% de ácido periódico durante 5 min. </li><li> Lavar tres veces en agua DI, sumergir una vez en agua miliQ. </li><li> Teñir con reactivo de Schiff durante 15 min a temperatur ambientee. </li><li> Lavar los portaobjetos en agua corriente del grifo durante 10 minutos, enjuague con agua DI. </li><li> Contrateñir en Surgipath hematoxilina durante 30 segundos a temperatura ambiente. </li><li> Lavado de los portaobjetos tres veces en agua DI. </li><li> Incubar los portaobjetos 30 segundos en agua del grifo de Scott a temperatura ambiente. </li><li> Lavar tres veces en agua DI. </li></ol></li><li> Deshidratar y aclarar portaobjetos mediante la incubación de 1 min en 95% de etanol, seguido de tres cambios rápidos en 100% de etanol, y tres cambios en Citrisolv, 2 min cada una. Todos a temperatura ambiente. </li><li> Montar las diapositivas en cubreobjetos con medio resinoso (Cytoseal 60). </li></ol> 5. Uso de lectinas y anticuerpos (Tabla 1) para detectar epítopes de glicano por métodos histoquímicos <ol><li> Para la detección de fluorescencia de tres epítopes de glicano utilizando lectinas, bloquear los portaobjetos con 1% de BSA en PBS durante 10-30 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Desde una lectina biotinilada se utiliza, bloquear la biotina endógena por incubación de 15 min con 0,1%Avidina, seguido por 15 min de incubación con 0,01% de biotina a temperatura ambiente. </li><li> Lavar los portaobjetos en PBS después de cada etapa de bloqueo. </li><li> Recién preparar una mezcla de 1 g / ml de rodamina conjugada con aglutinina de germen de trigo succinilada (sWGA), 1,3 mg / ml biotinilado aglutinina de Sambucus nigra (SNA) y 5 mg / ml de fluoresceína conjugado jacalin en HEPES / NaCl (10 mM HEPES, 150 mM NaCl pH 7,5). </li><li> Colocar los portaobjetos en una superficie plana o en una caja de tinción, y la capa de la mezcla de lectina en la parte superior. El volumen de la mezcla se puede reducir colocando suavemente Parafilm sobre el líquido, el parafilm aplana el líquido y evita la evaporación. </li><li> Incubar 1 hora a temperatura ambiente en la oscuridad. </li><li> Lavado de los portaobjetos tres veces con PBS. </li><li> Diapositivas capa con 0,7 ug / ml de estreptavidina conjugada con Cy5 (para detectar la biotina-SNA), y se incuba durante 30 min a temperatura ambiente en la oscuridad. </li><li> Lavado de los portaobjetos tres veces con PBS. </li><li> Contrateñir núcleos con 0,1 &amp; mu, g / ml DAPI. </li><li> Montar diapositivas en cubreobjetos con medio acuoso tal como VectaMount medios de montaje (o cualquier medio acuoso). </li></ol> 6. El control de la especificidad de tinción de lectina <ol><li> Especificidad tinción de lectina se controla por escisión enzimática específica de diana glicano epítopo antes de la tinción o por competencia con las moléculas pequeñas. </li><li> La escisión enzimática de Sambucus nigra aglutinina (SNA) especificidad de unión <ol><li> Diluir Arthrobacter ureafaciens sialidasa (AUS) a 250 mU / ml en 50 mM de acetato de sodio pH 5,5. </li><li> Añadir agua a la parte inferior de un vacío punta de la caja, esta formará una cámara húmeda durante la incubación. </li><li> Colocar los portaobjetos boca arriba en la bandeja superior de la punta de la caja, la capa de 150-200 l solución AUS en la diapositiva y cubrir con un cubreobjetos. Evitar la formación de burbujas de aire. </li><li> Cerrar la tapa de la caja y se incuba a 37 ° C durante 2,5 hr. </li><li> Lavado de los portaobjetos tres veces en PBS a temple habitacióntura para eliminar todos los ácidos siálicos libres. Estas diapositivas deben ser negativos para la tinción de SNA. </li></ol></li><li> Los inhibidores competitivos de jacalin y germen de trigo crioaglutininas succinilada especificidad (sWGA) <ol><li> Alícuota de 200 l de la mezcla preparada en la etapa lectina de 5,4 a dos viales Eppendorf. </li><li> Añadir 200 mM Melibiosa (inhibidor jacalin) a uno de los viales y quitina-hidrolizado a una dilución 1:10 (sWGA inhibidor) al otro vial. </li><li> Superposición de portaobjetos de control negativas con los inhibidores de las mezclas que contienen y se incuba 1 hora a temperatura ambiente al mismo tiempo que el resto de las diapositivas. Estas diapositivas deben ser negativos para jacalin o manchas sWGA, respectivamente. </li></ol></li></ol> 7. Los resultados representativos Una comparación entre las muestras de tejido embebidas en parafina de los tejidos congelados incrustados en crio-protectores de los medios de comunicación (OCT) reveló diferencia sorprendente en la conservación y la calidad de la tinción para mucin glicoproteínas. Tinción de tejidos con tintes histoquímicos, tales como Azul de Alcian y ácido periódico de Schiff, producen resultados muy diferentes en secciones de tejidos embebidos comparables de muestras congeladas o de parafina (Figura 1). Parece que el disolvente orgánico (xileno o Citrisolv) que se utiliza durante el proceso de incrustación de parafina afecta a la distribución de las mucinas secretadas en epitelios, así como la eliminación de la mayor parte de los glicolípidos de las muestras (Figura 2). Como resultado, la capa de moco aparecerá plegada en las células de la mucosa y se encuentra principalmente en las células caliciformes. Congelación de los tejidos en flash crio-protectores de los medios de comunicación (OCT) mantuvo la hidratación de la muestra y conserva las dimensiones mucinas secretadas capa. El proceso de inclusión en parafina afectados otros asociados moco-glicanos y glicolípidos de una manera similar. Glycan distribución se examinó utilizando lectinas, que se utilizan habitualmente para la detección de glicano (Figura 3) y anticuerpos contra epítopos que se encuentran enmucinas y glicolípidos (Figura 6). Debido a lectina de unión no está bien definida y es afectada por la distribución espacial de los glicanos, así como la estructura de glicano 14,15, es importante aplicar los controles apropiados para la tinción de lectina. Aquí se muestran dos métodos para el control de la tinción de lectina en los tejidos ensayados: La escisión enzimática y la inhibición competitiva. La escisión de los epítopes de glicano se realizó mediante la digestión de la sección de tejido con glicanos específicos de enzimas, por ejemplo sialidasa bacteriana como control para la unión de ácido siálico por SNA (Figura 4). En los casos en que la enzima específica (por ejemplo glicosidasa) no está disponible para retirar el epítopo glicano estudiado, especificidad lectina puede ser confirmado mediante la adición de un inhibidor competitivo como Melibiosa para la tinción jacalin o hidrolizado de quitina-para la tinción sWGA (Figura 5). Estamos aquí demostrar que se congelaron las muestras de tejido, que son routinely obtenida en la clínica y en los laboratorios de investigación, puede integrarse también en octubre y se utilizan para estudiar las glicoproteínas mucina y los glicanos presentes muchos de ellos. <table border="1"><tbody><tr><td> Lectina / Ab </td><td> Fuente </td><td> Mayor especificidad </td></tr><tr><td> LFA </td><td> Limax flavus (babosa amarilla) </td><td> Terminal Sia </td></tr><tr><td> MAA * </td><td> Maackia amurensis (Amur Maackia) </td><td> Siaα2-3Galβ1-R / 3-O-sulfato en Galβ1-R </td></tr><tr><td> SNA </td><td> Sambucus nigra (saúco) </td><td> Siaα2-6Gal / Siaα2-6GalNAc </td></tr><tr><td> Ventajas de Windows Original </td><td> Triticum vulgaris (germen de trigo) </td><td> GlcNAcβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc / Sia </td></tr><tr><td> sWGA </td><td> Triticum vulgaris succinilados (germen de trigo) </td><td> GlcNAc &amp; beta, 1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc </td></tr><tr><td> PNA </td><td> Arachis hypogaea (maní) </td><td> Galβ1-3GalNAc (sin modificar el antígeno T) </td></tr><tr><td> Jacalin </td><td> Artocarpus integrifolia (jacalin) </td><td> Galβ1-3GalNAc encontrado en O-glicanos ligados </td></tr><tr><td> ECA </td><td> Erythrina crista (árbol de Coral) </td><td> Galβ1-4GlcNAc </td></tr><tr><td> TKH2 </td><td> Anticuerpo </td><td> Siaa2-6GalNAc (STN) a O-glicanos ligados </td></tr><tr><td> CA19-9 </td><td> Anticuerpo </td><td> Siaa2-3Galβ1-4 (Fuca1-3) GlcNAc (SLE a) </td></tr><tr><td> SNH3 </td><td> Anticuerpo </td><td> Siaa2-3Galβ1-3 (Fuca1-4) GlcNAc (LES x) </td></tr></tbody></table> Abreviaturas: Ab, anticuerpos; Sia, ácido siálico; Gal, galactosa; GalNAc, <em&gt; N-acetilgalactosamina; GlcNAc, N-acetilglucosamina; Fuc, fucosa; STn, sialil Tn; SLe una, sialil Lewisa; x SLe, sialil Lewis x. * Las fuentes comerciales para incluir MAA MALI, MALII y TAC. Tabla 1. Una lista parcial de las lectinas y anticuerpos para epítopes de glicano. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3928/3928fig1.jpg" /> Figura 1. Alcian Blue y tinción ácido periódico de Schiff de tejidos de colon congeladas y en parafina. Las secciones de tejido de humano, de ratón o de pollo especímenes de colon congeladas en OCT (panel superior) o embebidos en parafina (panel inferior) se tiñeron con ácido peryódico de Schiff (PAS) o Alcian Blue (AB). Estos reactivos mancha de moco de color rosa o azul, respectivamente. Panel superior: En tejidos congelados, además de mucinas en las células caliciformes, moco secretado era también visible (flechas). Panel inferior: En tejidos incluidos en parafina, la tinción de moco se limitaba a las células caliciformes. Los núcleos se contratiñeron con Surgipath (PAS) o de hematoxilina de Mayer (AB). La barra de escala indica 100 micras. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3928/3928fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ampliar la cifra</a> . <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3928/3928fig2.jpg" /> Figura 2. Resultados Citrisolv de incubación en una pérdida sustancial de las mucinas. Las secciones seriadas de las muestras congeladas de pollo íleon fueron fijadas en 10% formalina tamponada y se mantiene hidratada (panel izquierdo), se deshidrataron en etanol mediante incubación secuencial en 70%, 90% y 100% de etanol durante 20 min cada (panel central), o se deshidrataron en etanol y se aclaró con Citrisolv durante 1 h (panel derecho). Muestras deshidratadas se rehidrataron volver a PBS antes de hematoxilina y eosina (H &amp; E) tinción con azul Alcian o. Etanol deshidratación y Citrisolv compensación mejorada tejido morfología (fila por ejemplo, superior, medio e imágenes derecha versus imagen de la izquierda). Deshidratación de etanol no tuvo ningún efecto significativo sobre la tinción con azul Alcian (fila del medio, comparar imágenes izquierda y centro). En contraste, la incubación Citrisolv tinción con Azul de Alcian reducido y confinado a las células caliciformes (fila del medio, imagen derecha) en un patrón que es similar a la observada en tejidos incluidos en parafina (Figura 1). Estos datos implican que la fuerte tinción de los gránulos de moco en las muestras incluidas en parafina se debe a la contracción y condensación de moco en las células caliciformes durante la etapa de compensación. La tinción más débil y menos densa de moco en octubre congeladas de tejidos embebidos refleja una distribución más natural de mucus en el tejido. Mayores aumentos de las zonas en caja están marcados con flechas. Las barras de escala indican 50 micras (filas superior y central) y 10 micras (fila inferior). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3928/3928fig3.jpg" /> Figura 3. La unión delectinas a epítopes de glicano sobre tejidos congelados y embebidos en parafina. Pollo intestino delgado (íleon) Las muestras congeladas en OCT (paneles superiores) o embebidos en parafina (paneles inferiores) se probaron con jacalin (azul), sWGA (verde) y SNA (rojo ). Mayores aumentos de las zonas en caja están marcados con flechas. En los tejidos congelados de unión a O-glicanos ligados jacalin reveló estructuras que parecían ser la exudación de células caliciformes en el lumen (jacalina, panel superior, flechas). En contraste, la unión a tejidos incluidos en parafina jacalin se limitaba a las células caliciformes (jacalina, panel inferior, flechas) y al borde en cepillo vellosidades (imagen inferior izquierda, flecha). tinción sWGA de β1-4GlcNAc parcialmente co-localizada con la unión de la lectina jacalin en ambos tejidos congelados (panel superior, flechas), y en tejidos incluidos en parafina (panel inferior, flechas). En contraste, la lectina SNA unión a α2-6 ácidos siálicos unidos es intracelular (SNA, puntas de flecha), y no co-localizar con jacalin (colorimagen, la SNA en rojo marcado con una flecha, jacalin en azul marcada con la flecha de puntos). Las barras de escala indican 100 micras (imagen izquierda) y 20 m (magnificadas áreas enmarcadas). <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3928/3928fig4.jpg" /> Figura 4. La escisión enzimática de control para la tinción de ácido siálico con SNA. Especímenes de pollo intestino delgado se incubaron con 250 mU / ml Arthrobacter ureafaciens sialidasa (AUS) o con 50 mM de acetato de sodio pH 5,5 tampón durante 2,5 horas a 37 ° C. AUS tratamiento elimina la tinción con biotina SNA, lo que confirma la especificidad de unión a ácidos SNA siálico. La barra de escala indica 100 micras. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3928/3928fig5.jpg" /> Figura 5. Control de inhibición competitiva para la tinción de glicano con jacalin y sWGA. Pollo intestino delgado (íleon) muestras fueron incubadas con una mezcla jacalin y sWGA en presencia de LEC específicainhibidores de estaño: melibiosa (columna central), quitina-hidrolizado (columna derecha) o sin inhibidor (A y D). Panel superior: (izquierda) tinción jacalin sin inhibidores. (Centro) jacalin tinción fue inhibida por Melibiosa. (Derecha), hidrolizado de quitina no inhibió la tinción jacalin. Panel inferior: (izquierda) tinción sWGA sin inhibidor. (Centro) Melibiosa no inhibió la tinción sWGA. (Derecha) tinción sWGA fue inhibida por quitina-hidrolizado. Esto confirma la inhibición de la interacción específica de lectinas con los tejidos. Los asteriscos marca de imagen de la inhibición de la tinción. La barra de escala indica 100 micras. <img alt="La figura 6" src="/files/ftp_upload/3928/3928fig6.jpg" /> Figura 6. La detección de las mucinas secretoras, glicolípidos y epítopes de glicano en congelados tejidos humanos con cáncer colorrectal. Biopsias de cáncer colorrectal carcinoma de las vellosidades y carcinoma mucoso se snap-congelado en nitrógeno líquido y se embebieron en octubre Las secciones de tejido se incubaron durante 1 hcon anticuerpos contra la mucina secretada MUC5AC, sialil Lewis a - glicano epítopo encontrado en gangliósidos (cáncer colorrectal marcador CA 19-9), y sialil-Tn - abundante epítopo de glicanos de las mucinas (detectada con TKH2 anticuerpo), seguido de 30 minutos de incubación con burro biotinilado anti-ratón IgG anticuerpo secundario, y 30 min de incubación con estreptavidina conjugada con peroxidasa. Otros tejidos se incubaron durante 1 h con el biotinilado SNA lectinas y sWGA, seguido de 30 minutos de incubación con estreptavidina conjugada con peroxidasa. Tinción de peroxidasa fue desarrollado utilizando AEC kit. Barra de escala indica Negro 200 micras.

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No hay conflictos de interés declarado.

La preservación de epítopos de moco y glicano en tejidos congelados es superior a la de los tejidos que se incluyeron en parafina. Hemos demostrado la preservación de la capa de mucosidad secretada (Figuras 1 y 3) y la distribución de las tres estructuras de glicanos (Figura 3) en tejidos congelados en comparación con tejidos incluidos en parafina. Fijadores especializados tales como una solución de Carnoy (60% de etanol, 30% de cloroformo, 10% de ácido acético) 17 se han desarrollado para la conservación óptima de la capa de moco en las muestras de tejido. De manera óptima, esta solución debería ser utilizado para recoger muestras de tejido que están dedicados para los estudios de moco y se muestra para conservar el aspecto liso de la capa de moco 16-17. La capa de moco en las muestras congeladas no fijadas incrustado en octubre aparece rugoso y en algunas zonas puede desprenderse del tejido, sin embargo, el espesor de la capa es en general de acuerdo con la observada en los tejidos que se fijaron con solución de Carnoy y embedded en parafina 16-17. Por ejemplo, la capa de moco congelado en la sección de tejido humano de colon es de ~ 100 m (Figura 1), que se encuentra dentro del rango reportado para Carnoy&#39;s fijo muestra colon humano 55,4 ± 2,5 micras (rango de 7,7 a 204,8 m) 16. Se ha sabido desde hace décadas que los resultados de deshidratación de etanol en ~ 30% la contracción de las muestras biológicas 18, y que los disolventes orgánicos tales como xileno, Citrisolv y lípidos extracto de cloroformo, glucolípidos y, en cierta medida, las proteínas de los tejidos 13. Procesamiento de tejidos para la inclusión en parafina incluye las siguientes etapas: fijación (10% formalina tamponada), deshidratación (aumento de la concentración de etanol) y de compensación (Citrisolv o xileno). Al imitar estos pasos no fijadas sobre secciones de tejido congeladas, hemos demostrado que Citrisolv extrae la mucosidad de las secciones de tejido congeladas resultantes en la morfología del tejido que es similar a la de los tejidos incluidos en parafina (Figure 2, panel derecho). En contraste, la capa de mucus no se alteró por la incubación con formalina o etanol (Figura 2, izquierda y paneles centrales). Esto sugiere que la etapa de compensación de procedimiento estándar de inclusión en parafina, que requiere una incubación prolongada en Citrisolv / xileno, da como resultado el colapso de la capa de moco. La fijación con formalina no daña la capa de moco y secciones de tejidos congelados que fueron fijadas con formalina fácilmente se puede teñir con lectinas y anticuerpos contra glicanos, glicolípidos y proteínas (Figuras 2, 3 y 6). Estos efectos pueden ser insignificantes para el estudio de las proteínas unidas a la membrana y el tejido patología, pero tienen efectos devastadores para las estructuras altamente hidratadas tales como la capa de moco secretado. Sin embargo los estudios histológicos de las mucinas están siendo llevados a cabo con muestras embebidas en parafina, en el que la preservación capa de moco es subóptima. En el análisis en profundidad de la capa de moco composición tal como la identidad exacta de sí mismocreted o unido a la membrana de glicoproteína MUC requieren combinaciones de anticuerpos específicos y espectrometría de masas para la identificación de las cadenas principales de proteínas. La preservación de la capa de moco es más que el primer requisito para dichos estudios. Muchos laboratorios han muestras de tejidos congelados en OCT que fueron recogidos en el pasado para diferentes proyectos, estos tejidos pueden usarse fácilmente para estudiar las mucinas, glicolípidos y de distribución de glicano que elimina la necesidad de recoger los tejidos en fijadores especiales que están diseñados exclusivamente para la preservación moco. Los tejidos congelados someterse a un procesamiento mínimo y por lo tanto la distribución natural de los glicanos, que son hidratados en la naturaleza, se conserva. Esto es especialmente importante en el campo de las interacciones huésped microbiano. El conocimiento de la distribución y abundancia de naturalista mucinas secretadas y las estructuras de glicanos muchas decorar estas moléculas &quot;barrera&quot; será clave en la comprensión de defensa del huésped, la explotación microbiana y patógenoses.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre de los reactivos y equipos </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> 2-metil butano </td><td> Fisher Scientific </td><td> 03551-4 </td></tr><tr><td> Peroxidasa sustrato AEC kit </td><td> Vector Labs </td><td> SK-4200 </td></tr><tr><td> Alcian Blue </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A3157 </td></tr><tr><td> Lucha contra el CA 19-9 anticuerpo monoclonal </td><td> Calbiochem </td><td> CA1003 </td></tr><tr><td> Lucha contra MUC5AC anticuerpos monoclonales </td><td> Millipore </td><td> MAB2011 </td></tr><tr><td> Avidina-biotina bloqueo kit </td><td> Vector Labs </td><td> SP-2001 </td></tr><tr><td> Burro biotinilado anti-ratón de anticuerpos </td><td> Jackson Immunoresearch </td><td> 90863 </td></tr><tr><td> Biotinylated SNA </td><td> Vector Labs </td><td> B-1305 </td></tr><tr><td> Albúmina de suero bovinomin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A4503 </td></tr><tr><td> La quitina-hidrolizado </td><td> Vector Labs </td><td> SP-0090 </td></tr><tr><td> Criostato micrótomo </td><td> Leica Microsystems </td><td> Leica CM 1800 </td></tr><tr><td> Hematoxilina </td><td> Surgipath Medical Ind. </td><td> 3801570 </td></tr><tr><td> El peróxido de hidrógeno 30% </td><td> Fisher Scientific </td><td> H325-100 </td></tr><tr><td> Jacalin-FITC </td><td> Vector Labs </td><td> FL-1151 </td></tr><tr><td> Hematoxilina de Mayer </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> MHS32 </td></tr><tr><td> Melibiosa </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M5500 </td></tr><tr><td> Nuclear Fast Red </td><td> Vector Labs </td><td> H-3403 </td></tr><tr><td> Octubre compuesto </td><td> VWR International </td><td> 25608-930 </td></tr><tr><td> Estreptavidina conjugada con peroxidasa </td><td> Jackson Immunoresearch </td><td> 94638 </td></tr><tr><td> Schiff reactivo </td><td> Microscopía Electrónica de Ciencias </td><td> 26052 </td></tr><tr><td> sWGA-Rodamina </td><td> Vector Labs </td><td> RL1022S </td></tr><tr><td> TKH2 anticuerpo monoclonal </td><td> ATCC </td><td> HB-9654 </td></tr><tr><td> VectaMount medios acuosos de montaje </td><td> Vector Labs </td><td> H-5501 </td></tr><tr><td> Cytoseal 60 </td><td> Thermo Scientific </td><td> 8310-4 </td></tr><tr><td> Peel-A-Way moldes </td><td> Polysciences Inc. </td><td> 18646A-1 </td></tr></tbody></table>

using unfixed, frozen tissues to study natural mucin distribution

Las mucinas son complejos y fuertemente glicosilada unidos a O glicoproteínas, que contienen más de 70% en peso de carbohidratos 1-3. Mucinas secretadas, producida por las células caliciformes y la mucosa gástrica, el andamio para proporcionar una capa de moco micrómetros de espesor que recubre el epitelio del intestino y el tracto respiratorio 3,4. Además de las mucinas, las capas de moco también contienen péptidos antimicrobianos, citoquinas, y las inmunoglobulinas 5-9. La capa de moco es una parte importante de la inmunidad innata del huésped, y constituye la primera línea de defensa contra los microorganismos invasores 8,10-12. Como tal, el moco está sujeta a numerosas interacciones con microbios, ambos patógenos y simbiontes, y mucinas secretadas forman una interfaz importante para estas interacciones. El estudio de tales interacciones biológicas generalmente implica métodos histológicos para la recogida de tejido y la tinción. Los dos métodos más comúnmente utilizados para la recogida de tejidos histológicos y preserción en la clínica y en los laboratorios de investigación son: la fijación en formol seguido por inclusión en parafina, y la congelación de tejidos, seguido de la incorporación en la crio-protectores de los medios de comunicación. Embebidos en parafina las muestras de tejido producir secciones con cualidades óptimas para la visualización histológica que incluyen la claridad y la morfología bien definida. Sin embargo, durante el proceso de inclusión en parafina de un número de epítopos se altera y con el fin de estudiar estos epítopos, las secciones de tejido tiene que ser procesado con uno de los muchos métodos de recuperación del epítopo 13. Mucinas secretadas y los lípidos se extraen del tejido durante la etapa de compensación de inclusión en parafina, que requiere prolongar la incubación con solventes orgánicos (xileno o Citrisolv). Por lo tanto, este enfoque es sub-óptimo para estudios centrados en la naturaleza y distribución de las mucinas y moco in vivo. Por el contrario, los tejidos de congelación en la temperatura óptima de corte (OCT) un medio de inclusiónanula la deshidratación y la limpieza de la muestra, y mantiene la hidratación de la muestra. Esto permite una mejor conservación de la capa de moco hidratado, y por lo tanto permite el estudio de las numerosas funciones de las mucinas en la biología epitelial. Como este método requiere un procesamiento mínimo del tejido, el tejido se conserva en un estado más natural. Por lo tanto congelados secciones tejidos no requieren ningún procesamiento adicional antes de la tinción y pueden ser fácilmente analizados usando métodos de inmunohistoquímica. Se demuestra la conservación de los micrómetros de espesor capa de mucus secretado en muestras de colon congelados. Esta capa se reduce drásticamente cuando los mismos tejidos se incrustan en parafina. También se demuestra la tinción de inmunofluorescencia de epítopes de glicano presentados en mucinas utilizando lectinas de plantas. La ventaja de este enfoque es que no requiere el uso de fijadores especiales y permite la utilización de tejidos congelados que pueden estar ya conservados en el laboratorio.

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Using Unfixed, Frozen Tissues to Study Natural Mucin Distribution

Muestras de tejido congeladas no fijadas embebidas en un medio de temperatura óptima de corte (OCT) se puede utilizar para estudiar la distribución natural y glicosilación de moco secretado. En este enfoque de procesado de tejido es mínima y la presentación natural de glicolípidos, mucinas y glycan epítopos-se conserva. Las secciones de tejido pueden ser analizadas por inmunohistoquímica usando detección de fluorescencia o cromogénico.

El uso de tejidos no fijadas, congeladas para estudiar la distribución de mucina Natural

Mucins are complex and heavily glycosylated O-linked glycoproteins, which contain more than 70% carbohydrate by weight1-3. Secreted mucins, produced by ...

using-unfixed-frozen-tissues-to-study-natural-mucin-distribution

Research

JoVE Journal

Biology

47.5K vistas.  University of California, San Diego. Muestras de tejido congeladas no fijadas embebidas en un medio de temperatura óptima de corte (OCT) se puede utilizar para estudiar la distribución natural y glicosilación de moco secretado. En este enfoque de procesado de tejido es mínima y la presentación natural de glicolípidos, mucinas y glycan epítopos-se conserva. Las secciones de tejido pueden ser analizadas por inmunohistoquímica usando detección de fluorescencia o cromogénico.

Video: Using Unfixed, Frozen Tissues to Study Natural Mucin Distribution

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

Prueba de sensibilidad visual a la velocidad y dirección del movimiento en lagartos

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Investigación

Biología

Computer-Generated Animal Model Stimuli

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In particular, understanding the constraints on visual signal design for communication has been of great interest. Traditional methods for investigating animal interactions have used basic observational techniques, staged encounters, or physical manipulation of morphology. Less intrusive methods have tried to simulate conspecifics using crude playback tools, such as mirrors, still images, or models. As technology has become more advanced, video playback has emerged as another tool in which to examine visual communication (Rosenthal, 2000). However, to move one step further, the application of computer-animation now allows researchers to specifically isolate critical components necessary to elicit social responses from conspecifics, and manipulate these features to control interactions. Here, I provide detail on how to create an animation using the Jacky dragon as a model, but this process may be adaptable for other species. In building the animation, I elected to use Lightwave  3D to alter object morphology, add texture, install bones, and provide comparable weight shading that prevents exaggerated movement. The animation is then matched to select motor patterns to replicate critical movement features. Finally, the sequence must rendered into an individual clip for presentation. Although there are other adaptable techniques, this particular method had been demonstrated to be effective in eliciting both conspicuous and social responses in staged interactions.

Computer-generated stimuli using the Jacky dragon as a model.

Los estímulos generados por ordenador Modelo animal

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish1-5. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adult zabrafish. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish with our simple custom-built apparatus using a new protocol which is established in our lab. Both our apparatus and step-by-step procedure of OKR in adult zebrafish are illustrated in this video. In addition, the measurements of the larval OKR, as well as the optomotor response (OMR) test of adult zebrafish, are also demonstrated in this video. This OKR assay of adult zebrafish in our experiment may last for up to 4 hours. Such OKR test applied in adult fish will benefit to visual function investigation more efficiently when the adult fish vision system is manipulated.
Su-Qi Zou and Wu Yin contributed equally to this paper.

Optokinetic response has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adults1-5. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish using a new protocol which is established in our lab.

Usando la respuesta de optocinético para estudiar la función visual del pez cebra

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the ...

Reverse Genetic Morpholino Approach Using Cardiac Ventricular Injection to Transfect Multiple Difficult-to-target Tissues in the Zebrafish Larva

The zebrafish is an important model to understand the cell and molecular biology of organ and appendage regeneration. However, molecular strategies to employ reverse genetics have not yet been adequately developed to assess gene function in regeneration or tissue homeostasis during larval stages after zebrafish embryogenesis, and several tissues within the zebrafish larva are difficult to target. Intraventricular injections of gene-specific morpholinos offer an alternative method for the current inability to genomically target zebrafish genes in a temporally controlled manner at these stages. This method allows for complete dispersion and subsequent incorporation of the morpholino into various tissues throughout the body, including structures that were formerly impossible to reach such as those in the larval caudal fin, a structure often used to noninvasively research tissue regeneration. Several genes activated during larval finfold regeneration are also present in regenerating adult vertebrate tissues, so the larva is a useful model to understand regeneration in adults. This morpholino dispersion method allows for the quick and easy identification of genes required for the regeneration of larval tissues as well as other physiological phenomena regulating tissue homeostasis after embryogenesis. Therefore, this delivery method provides a currently needed strategy for temporal control to the evaluation of gene function after embryogenesis.&#160;

An adaptable reverse genetic method for zebrafish to assess gene function during later stages of development and physiological homeostasis such as tissue regeneration using intraventricular injections of gene-specific morpholinos.

Invierta genética Enfoque Morpholino Usando ventricular cardíaca inyección para transfectar múltiples tejidos difíciles de conectar por objetivo en el pez cebra Larva

The zebrafish is an important model to understand the cell and molecular biology of organ and appendage regeneration. However, molecular strategies to ...

High-throughput Image Analysis of Tumor Spheroids: A User-friendly Software Application to Measure the Size of Spheroids Automatically and Accurately

The increasing number of applications of three-dimensional (3D) tumor spheroids as an in vitro model for drug discovery requires their adaptation to large-scale screening formats in every step of a drug screen, including large-scale image analysis. Currently there is no ready-to-use and free image analysis software to meet this large-scale format. Most existing methods involve manually drawing the length and width of the imaged 3D spheroids, which is a tedious and time-consuming process. This study presents a high-throughput image analysis software application &#8211; SpheroidSizer, which measures the major and minor axial length of the imaged 3D tumor spheroids automatically and accurately; calculates the volume of each individual 3D tumor spheroid; then outputs the results in two different forms in spreadsheets for easy manipulations in the subsequent data analysis. The main advantage of this software is its powerful image analysis application that is adapted for large numbers of images. It provides high-throughput computation and quality-control workflow. The estimated time to process 1,000 images is about 15 min&#160;on a minimally configured laptop, or around 1 min&#160;on a multi-core performance workstation. The graphical user interface (GUI) is also designed for easy quality control, and users can manually override the computer results. The key method used in this software is adapted from the active contour algorithm, also known as Snakes, which is especially suitable for images with uneven illumination and noisy background that often plagues automated imaging processing in high-throughput screens. The complimentary &#8220;Manual Initialize&#8221; and &#8220;Hand Draw&#8221; tools provide the flexibility to SpheroidSizer in dealing with various types of spheroids and diverse quality images. This high-throughput image analysis software remarkably reduces labor and speeds up the analysis process. Implementing this software is beneficial for 3D tumor spheroids to become a routine in vitro model for drug screens in industry and academia.

We present a high-throughput image analysis software application to measure the size of three-dimensional tumor spheroids imaged with bright-field microscopy. This application provides a fast and effective way to examine the effects of therapeutic drugs on spheroids, which is beneficial for researchers who wish to use spheroids in drug screens.

De alto rendimiento de imagen Análisis de esferoides tumorales: una aplicación de software fácil de usar para medir el tamaño de esferoides forma automática y precisa

The increasing number of applications of three-dimensional (3D) tumor spheroids as an in vitro model for drug discovery requires their adaptation to ...

Using Mouse Mammary Tumor Cells to Teach Core Biology Concepts: A Simple Lab Module

Undergraduate biology students are required to learn, understand and apply a variety of cellular and molecular biology concepts and techniques in preparation for biomedical, graduate and professional programs or careers in science. To address this, a simple laboratory module was devised to teach the concepts of cell division, cellular communication and cancer through the application of animal cell culture techniques. Here the mouse mammary tumor (MMT) cell line is used to model for breast cancer. Students learn to grow and characterize these animal cells in culture and test the effects of traditional and non-traditional chemotherapy agents on cell proliferation. Specifically, students determine the optimal cell concentration for plating and growing cells, learn how to prepare and dilute drug solutions, identify the best dosage and treatment time course of the antiproliferative agents, and ascertain the rate of cell death in response to various treatments. The module employs both a standard cell counting technique using a hemocytometer and a novel cell counting method using microscopy software. The experimental procedure lends to open-ended inquiry as students can modify critical steps of the protocol, including testing homeopathic agents and over-the-counter drugs. In short, this lab module requires students to use the scientific process to apply their knowledge of the cell cycle, cellular signaling pathways, cancer and modes of treatment, all while developing an array of laboratory skills including cell culture and analysis of experimental data not routinely taught in the undergraduate classroom.

A feasible laboratory module for biology undergraduates that explores advanced cellular and molecular concepts using animal cell culture is described. Students grow, characterize and manipulate a breast cancer cell model by exposure to chemotherapy agents. Cell viability is assayed through cell counting using both a standard and novel method.

El uso de células tumorales mamarias de ratón para enseñar conceptos básicos de biología: Un módulo de laboratorio simple

Undergraduate biology students are required to learn, understand and apply a variety of cellular and molecular biology concepts and techniques in ...

Using Caco-2 Cells to Study Lipid Transport by the Intestine

Studies of dietary fat absorption are generally conducted by using an animal model equipped with a lymph cannula. Although this animal model is widely accepted as the in vivo model of dietary fat absorption, the surgical techniques involved are challenging and expensive. Genetic manipulation of the animal model is also costly and time consuming. The alternative in vitro model is arguably more affordable, timesaving, and less challenging. Importantly, the in vitro model allows investigators to examine the enterocytes as an isolated system, reducing the complexity inherent in the whole organism model. This paper describes how human colon carcinoma cells (Caco-2) can serve as an in vitro model to study the enterocyte transport of lipids, and lipid-soluble drugs and vitamins. It explains the proper maintenance of Caco-2 cells and the preparation of their lipid mixture; and it further discusses the valuable option of using the permeable membrane system. Since differentiated Caco-2 cells are polarized, the main advantage of using the permeable membrane system is that it separates the apical from the basolateral compartment. Consequently, the lipid mixture can be added to the apical compartment while the lipoproteins can be collected from the basolateral compartment. In addition, the effectiveness of the lentivirus expression system in upregulating gene expression in Caco-2 cells is discussed. Lastly, this paper describes how to confirm the successful isolation of intestinal lipoproteins by transmission electron microscopy (TEM).

Caco-2 cells can serve as an in vitro model to study the enterocyte transport of lipids, and lipid-soluble drugs/vitamins. The permeable membrane system separates the apical from the basolateral compartment, while the lentivirus expression system offers an effective gene overexpression method. The isolation of lipoproteins is confirmed by TEM.

El uso de células Caco-2 para el Estudio de lípidos Transporte por el Intestino

Studies of dietary fat absorption are generally conducted by using an animal model equipped with a lymph cannula. Although this animal model is widely ...

Mucin Agarose Gel Electrophoresis: Western Blotting for High-molecular-weight Glycoproteins

Mucins, the heavily-glycosylated proteins lining mucosal surfaces, have evolved as a key component of innate defense by protecting the epithelium against invading pathogens. The main role of these macromolecules is to facilitate particle trapping and clearance while promoting lubrication of the mucosa. During protein synthesis, mucins undergo intense O-glycosylation and multimerization, which dramatically increase the mass and size of these molecules. These post-translational modifications are critical for the viscoelastic properties of mucus. As a result of the complex biochemical and biophysical nature of these molecules, working with mucins provides many challenges that cannot be overcome by conventional protein analysis methods. For instance, their high-molecular-weight prevents electrophoretic migration via regular polyacrylamide gels and their sticky nature causes adhesion to experimental tubing. However, investigating the role of mucins in health (e.g., maintaining mucosal integrity) and disease (e.g., hyperconcentration, mucostasis, cancer) has recently gained interest and mucins are being investigated as a therapeutic target. A better understanding of the production and function of mucin macromolecules may lead to novel pharmaceutical approaches, e.g., inhibitors of mucin granule exocytosis and/or mucolytic agents. Therefore, consistent and reliable protocols to investigate mucin biology are critical for scientific advancement. Here, we describe conventional methods to separate mucin macromolecules by electrophoresis using an agarose gel, transfer protein into nitrocellulose membrane, and detect signal with mucin-specific antibodies as well as infrared fluorescent gel reader. These techniques are widely applicable to determine mucin quantitation, multimerization and to test the effects of pharmacological compounds on mucins.

Mucins are high-molecular-weight glycoconjugates, with size ranging from 0.2 to 200 megadalton (MDa). As a result of their size, mucins do not penetrate conventional polyacrylamide gels and require larger pores for separation. We provide a detailed protocol for mucin agarose gel electrophoresis to assess relative quantification and study polymer assembly.

La mucina en gel de agarosa de electroforesis: Western Blotting para glicoproteínas de alta peso molecular


Mucins, the heavily-glycosylated proteins lining mucosal surfaces, have evolved as a key component of innate defense by protecting the epithelium against ...

Deploying Community Scientists to Conduct Nondestructive Genetic Sampling of Rare Butterfly Populations

Global insect declines continue to accelerate. Effective genetic sampling is critically needed to advance the understanding of many taxa and address existing knowledge gaps. This protocol represents a demonstrated method for nondestructively sampling rare butterflies for population genetic structure or DNA barcoding analyses. It uses the chorion of hatched butterfly ovae to yield sufficiently high quantity and quality DNA for successful gene sequencing to confirm species identity and quantify genetic variation. It may be particularly useful when other tissue sampling techniques are impractical or unavailable. While developed for a lepidopteran, it nonetheless could easily be adapted for use with other insect species. It was specifically designed with ease of use as a goal to help maximize broad implementation by individuals of varying experience and skill levels, such as community scientists, conservation practitioners, and students, and for use over large geographic areas to facilitate broad population sampling. The data generated can help inform taxonomic and listing decisions, conservation and management actions, and enhance basic ecological research.

Here, we present a straightforward protocol for noninvasive genetic sampling of butterfly populations based on the field collection of residual egg debris. It can be used to confirm species identity and quantify genetic variation. This protocol can be easily adapted to broader groups for community science involvement.

Despliegue de científicos comunitarios para realizar muestreos genéticos no destructivos de poblaciones de mariposas raras

Global insect declines continue to accelerate. Effective genetic sampling is critically needed to advance the understanding of many taxa and address ...

Aislamiento y perfilado de núcleos individuales de tejidos de mamíferos congelados

A Simple, Quick, and Partially Automated Protocol for the Isolation of Single Nuclei from Frozen Mammalian Tissues for Single Nucleus Sequencing

Single-cell and single-nucleus RNA sequencing have become common laboratory applications due to the wealth of transcriptomic information that they provide. Single nucleus RNA sequencing, particularly, is useful for investigating gene expression in difficult-to-dissociate tissues. Furthermore, this approach is also compatible with frozen (archival) material. Here, we describe a protocol to isolate high-quality single nuclei from frozen mammalian tissues for downstream single nucleus RNA sequencing in a partially-automated manner using commercially available instruments and reagents. Specifically, a robotic dissociator is used to automate and standardize tissue homogenization, followed by an optimized chemical gradient to filter the nuclei. Lastly, we accurately and automatically count the nuclei using an automated fluorescent cell counter. The performance of this protocol is demonstrated on mouse brain, rat kidney, and cynomolgus liver and spleen tissue. This protocol is straightforward, rapid, and readily adaptable to various mammalian tissues without requiring extensive optimization and provides good quality nuclei for downstream single nuclei RNA sequencing.

Autor destacado: Mejora del descubrimiento de fármacos: desarrollo de protocolos automatizados y estandarizados para la extracción de núcleos de tejidos congelados 

The study describes a simple, quick, and partially automated protocol to isolate high-quality nuclei from frozen mammalian tissues for downstream single nuclei RNA sequencing.

Un protocolo simple, rápido y parcialmente automatizado para el aislamiento de núcleos individuales de tejidos de mamíferos congelados para la secuenciación de núcleos únicos