Los autores agradecen a todas las mujeres que dieron su consentimiento y donaron muestras para este estudio.

El contenido y el protocolo de la investigación han sido revisados éticamente y aprobados por el comité de ética de investigación del Hospital de Urología Shenzhen Zhongshan. Todas las mujeres (de 20 a 40 años) que participaron en el estudio dieron su consentimiento informado para la recolección y el uso de la muestra.
1. Adquisición de tejido patológico
<ol><li>Prepare las herramientas para la recolección de pañuelos, a saber, la regla de medición, la pinza, el casete de inclusión, el papel de incrustación y la canasta de pañuelos.</li>
	<li>Observe si la cantidad de tejido endometrial (más grande que un frijol mungo), recolectado mediante un abordaje estándar con un catéter de pipella, es suficiente.</li>
	<li>Transfiera el tejido endometrial de la formalina al papel de inclusión con pinzas y mida las dimensiones del tejido endometrial con una regla.</li>
	<li>Envuelva el tejido endometrial con papel de inclusión y colóquelo en un casete de inclusión.</li>
	<li>Coloque el casete de inclusión en la canasta de pañuelos para deshidratarlo.</li>
</ol>2. Deshidratación de tejidos
<ol><li>Coloque la canasta de pañuelos en la cámara de reacción del deshidratador (consulte la Tabla de materiales) e inicie el procedimiento para la deshidratación de tejidos de rutina: formol durante 100 minutos; formol durante 100 min; 75% de alcohol durante 60 min; 85% de alcohol durante 60 min; 95% de alcohol durante 60 min; 100% alcohol durante 60 min; 100% alcohol durante 60 min; 100% alcohol durante 60 min; xileno durante 35 min; xileno durante 20 min; xileno durante 20 min; cera durante 80 min; cera durante 80 min; Cera durante 80 min. El proceso dura unas 15 h.</li>
	<li>Al final del procedimiento de deshidratación de tejidos, abra la cámara de reacción del deshidratador, retire la canasta de tejidos.</li>
</ol>3. Inclusión de tejidos
<ol><li>Saque un molde de inclusión adecuado según el tamaño de la muestra y llénelo con cera de parafina a 70 ° C.</li>
	<li>Coloque rápidamente el pañuelo en el molde y ajústelo con cuidado para que el tejido quede ubicado en el centro del molde.</li>
	<li>Mueva el molde suavemente a la placa de enfriamiento y presione suavemente el pañuelo mientras la parafina en la parte inferior se asienta.</li>
	<li>Coloque el casete de incrustación encima del molde y rellene con más cera.</li>
	<li>Coloque el molde en la placa de enfriamiento y, cuando la parafina esté completamente solidificada, retire el bloque con su casete adjunto lejos del molde.</li>
</ol>4. Secciones de tejido
<ol><li>Inserte el bloque en el clip de muestra del micrótomo, coloque la cuchilla en el soporte, ajuste el ángulo entre el plano del bloque y la cuchilla, ajuste el grosor de la sección a 4 μm, gire el volante y comience el corte.</li>
	<li>Exponga la superficie de tejido adecuada cortando algunas secciones delgadas del bloque. Saca las secciones continuas y completas con el pincel.</li>
	<li>Cuando se corten suficientes secciones, deje de girar el volante, retire las secciones no calificadas en la parte delantera con pinzas y haga flotar las secciones en la superficie de agua a 42 ° C en el baño de agua con pinzas y cepillo.</li>
	<li>Una vez que las secciones estén completamente aplanadas, recoja las secciones en portaobjetos antidesprendimiento y transfiéralas a un calentador de portaobjetos a 65 °C para hornear durante 60 minutos.</li>
	<li>Cuando termine de hornear, saque los portaobjetos de vidrio del calentador de portaobjetos.</li>
</ol>5. Tinción inmunohistoquímica
<ol><li>Diluya el anticuerpo primario en una solución funcional con diluyente de anticuerpos. Consulte la Tabla 1 para obtener más detalles.</li>
	<li>Coloque la solución de anticuerpos diluida en un frasco de reactivo especial y el kit de detección en el compartimiento de reactivos de un instrumento automático de tinción IHQ (consulte la Tabla de materiales).</li>
	<li>Coloque los portaobjetos en un soporte para portaobjetos, cubierto con un vértice especial, e insértelos en el compartimento de reacción experimental del instrumento.</li>
	<li>Después de que el instrumento reconozca automáticamente el reactivo y la información experimental en el portaobjetos, haga clic en el botón Inicio para iniciar la tinción inmunohistoquímica. El experimento tiene una duración aproximada de 3 h.</li>
</ol>6. Deshidratación y sellado del portaobjetos
<ol><li>Después de la tinción inmunohistoquímica, saque el portaobjetos, retire el vértice especial, coloque el portaobjetos teñido en el portaobjetos y lave el tinte restante del portaobjetos con agua limpia.</li>
	<li>Transfiera el portaobjetos a un cubreobjetos automatizado (consulte la Tabla de materiales), seleccione y ejecute el procedimiento de deshidratación y sellado.</li>
	<li>Saque los portaobjetos después de deshidratarlos y sellarlos.</li>
</ol>7. Escaneo de diapositiva
<ol><li>Coloque los portaobjetos en el soporte de portaobjetos del escáner panorámico de imágenes patológicas (consulte la Tabla de materiales) y colóquelo en el compartimento de escaneo de portaobjetos del instrumento para el escaneo de imágenes patológicas panorámicas. El escaneo tarda 2 min. Véase la figura 1.</li>
</ol>8. Análisis de imágenes
<ol><li>Importar imagen<ol><li>Abra el software de análisis de imágenes patológicas (consulte Tabla de materiales) y cree una nueva carpeta. Importar imágenes inmunohistoquímicas para ser analizadas.</li>
	</ol></li>
	<li>Construir un clasificador de tejidos<ol><li>Marque varios tejidos y una anotación en blanco para entrenar y establecer un clasificador para identificar el tejido y el área en blanco, respectivamente.</li>
		<li>Utilice el ajuste en tiempo real para observar la capacidad de reconocimiento del software en tiempo real durante la anotación de marcas. Si el reconocimiento no es oportuno, retome la anotación y vuelva a entrenar hasta que el reconocimiento de tejidos sea preciso.</li>
	</ol></li>
	<li>Algoritmo de análisis de compilación<ol><li>Seleccione el algoritmo estándar en el software de acuerdo con el tipo de experimento: IHC múltiplex.</li>
		<li>Establezca los parámetros de color del reconocimiento de celdas seleccionando píxeles negativos y positivos típicos. Sobre esta base, establezca los parámetros del núcleo, el citoplasma y la membrana celular, y observe la situación de reconocimiento celular en tiempo real hasta que se hayan encontrado los parámetros más adecuados para la imagen.</li>
		<li>Establezca el umbral de reconocimiento de celdas positivo y observe la situación de reconocimiento en tiempo real hasta que se ajuste el umbral apropiado.</li>
		<li>Seleccione el clasificador de tejido en el algoritmo y verifique la parte de tejido en el clasificador de tejido, para identificar las células sobre la base de los tejidos. En este punto, se completa el establecimiento de un algoritmo de análisis.</li>
	</ol></li>
	<li>Ejecutar análisis de imágenes<ol><li>Seleccione el área de análisis. Utilice el algoritmo establecido para analizar imágenes.</li>
	</ol></li>
	<li>Una vez finalizado el análisis del software, compruebe manualmente si el reconocimiento de imágenes es preciso, incluido el reconocimiento de tejidos, el reconocimiento de células negativas y positivas.</li>
	<li>Si el reconocimiento de imágenes no es preciso, vuelva a ajustar el algoritmo y el umbral de parámetros, y vuelva a ejecutar el análisis de imágenes hasta que se realice correctamente. Exporte los resultados del análisis. Véase la figura 1.</li>
	<li>También se pueden analizar otras células inmunitarias de acuerdo con los pasos anteriores (véase la figura 1). Establecer diferentes parámetros de análisis en función de la expresión real de diferentes marcadores inmunitarios endometriales (células CD56+uNK, Foxp3+Tregs, macrófagos CD68+, macrófagos CD163+M2, CD1a+DCs y células CD8+T25,26).</li>
	<li>A través del cálculo del software, se obtiene la proporción de células inmunes endometriales (ver Tabla 2). Utilícelo para evaluar los niveles de varias células inmunitarias en el endometrio de pacientes con abortos espontáneos recurrentes.</li>
</ol>

Análisis de imagen de tejido endometrial teñido inmunohistoquímicamente

<ol>
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Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo estableció una plataforma digital de análisis de imágenes inmunohistoquímicas para analizar cuantitativamente las células inmunitarias endometriales de pacientes con RM. En este caso, se detectaron seis marcadores inmunitarios endometriales para evaluar el microambiente inmunitario endometrial en pacientes con RM.
Un endometrio receptivo durante la fase lútea media es clave para el éxito de la implantación y el embarazo27,28<sup class="...

El aborto espontáneo recurrente (RM) es la pérdida de dos o más embarazos consecutivos y es una enfermedad compleja que ha llamado la atención de los médicos en los últimos años. La tasa de incidencia de RM en mujeres en edad fértil es del 1%-5% 1. Los resultados de estudios previos muestran que los factores inmunes están estrechamente asociados con la patogénesis de RM 2,3,4,5. El mantenimiento de la homeostasis inmunitaria en la interfaz materno-fetal es necesario para la implantación y el desarrollo embrionario. Las células inmunitarias endometriales desempeñan varias funciones reguladoras para mantener esta homeostasis, como promover la invasión del trofoblasto, remodelar las arterias espirales y contribuir al desarrollo de la placenta 6,7,8,9.
Se han reportado previamente células inmunitarias endometriales aberrantes en mujeres con RM. Los resultados muestran una estrecha asociación entre la alta densidad de células asesinas naturales uterinas (uNK) y la ocurrencia de RM10,11,12. Se ha descrito un aumento del número de macrófagos en el endometrio de mujeres con RM, en comparación con las que tuvieron un nacido vivo13. Las células T reguladoras (Treg) desempeñan un papel en la inmunidad materna hacia el embrión, y su nivel y función están disminuidos en la decidua de los pacientes con RM14. Los linfocitos T (CTL) y los linfocitos dendríticos (CD) también desempeñan un papel en la regulación inmunitaria del embarazo15,16. Por lo tanto, un análisis cuantitativo exhaustivo de las células inmunitarias endometriales locales durante la fase lútea media podría ayudar a comprender mejor la patogénesis de la RM. Algunos métodos actuales para el análisis cuantitativo de las células inmunitarias endometriales utilizan la citometría de flujo, que puede etiquetar con precisión las células inmunitarias con múltiples marcadores17,18. Sin embargo, la aplicación clínica de la citometría de flujo es limitada porque solo se puede realizar en tejido fresco. La obtención de tejido fresco solo es factible cuando se dispone de un gran volumen de exceso de tumor, algo poco frecuente en el endometrio. La inmunohistoquímica puede observar bien la morfología de los tejidos in situ y también puede marcar varias células inmunitarias, mientras que las técnicas inmunohistoquímicas tradicionales no pueden realizar análisis cuantitativos de las células inmunitarias.
En comparación con los experimentos de inmunohistoquímica convencionales, el análisis inmunohistoquímico cuantitativo de las células inmunitarias del endometrio tiene una importancia clínica importante. La puntuación de la intensidad de la IHQ suele clasificarse en una escala de cuatro puntos o fuerte y débil en el diagnóstico patológico y la investigación 19,20,21. Sin embargo, esta técnica semicuantitativa es subjetiva, altamente inexacta y demuestra una variabilidad significativa intraobservador e interobservador22. Una posible solución es la aplicación del aprendizaje automático, que es valioso en el análisis de imágenes digitales23,24. Al proporcionar mediciones cuantitativas, este enfoque permite una evaluación más precisa de la infiltración, distribución y densidad de las células inmunitarias dentro del tejido uterino. Esta información cuantitativa puede ayudar a dilucidar los cambios dinámicos en las poblaciones de células inmunitarias durante el ciclo menstrual y en diversas condiciones patológicas. En general, la capacidad de analizar cuantitativamente las células inmunitarias del endometrio a través de la inmunohistoquímica ofrece información valiosa sobre el microambiente inmunitario del útero.
Por lo tanto, el protocolo tenía como objetivo desarrollar y validar una plataforma digital de análisis de imágenes inmunohistoquímicas para analizar cuantitativamente las células inmunitarias endometriales, incluidas las células uNK, Tregs, macrófagos, CD y células T citotóxicas durante la fase lútea media en pacientes con RM.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Automated coverslipper</td>
			<td>Sakuraus</td>
			<td>DRS-Prisma-P-JCS&#38;Film-JC2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD163</td>
			<td>GrowGn Biotechnology</td>
			<td>NCL-L-CD163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD1a</td>
			<td>Gene Tech</td>
			<td>GM357129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD56</td>
			<td>Gene Tech</td>
			<td>GT200529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8</td>
			<td>Novocastra</td>
			<td>NCL-L-CD8-4B11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dehydrator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Excelsior ES</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital pathology and</td>
			<td>Indica labs</td>
			<td>HALO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foxp3</td>
			<td>YILIFANG biological</td>
			<td>14-477-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IHC stainer</td>
			<td>Leica</td>
			<td>BOND III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis platform</td>
			<td>Indica labs</td>
			<td>HALO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide Scanner</td>
			<td>Olympus life science</td>
			<td>VS200</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

platform for quantitative detection of endometrial immune cells based on immunohistochemistry and digital image analysis

Para evaluar el microambiente inmune endometrial de pacientes con aborto espontáneo recurrente (RM), se desarrolló y validó una plataforma de análisis de imágenes inmunohistoquímicas digitales para analizar cuantitativamente las células inmunes endometriales durante la fase lútea media. Todas las muestras de endometrio se recogieron durante la fase lútea media del ciclo menstrual. Los tejidos endometriales incluidos en parafina se seccionaron en portaobjetos de 4 μm de espesor y se llevó a cabo una tinción inmunohistoquímica (IHQ) para detectar células inmunitarias endometriales, incluidas las células uNK CD56+, las Tregs Foxp3+, los macrófagos CD163+ M2, las CD CD1a+ y las células T CD8+. Las diapositivas panorámicas se escanearon con un escáner digital de diapositivas y se utilizó un sistema comercial de análisis de imágenes para el análisis cuantitativo. El porcentaje de células inmunitarias endometriales se calculó dividiendo el número de células inmunitarias en el total de células endometriales. Utilizando el sistema comercial de análisis de imágenes, la evaluación cuantitativa de las células inmunitarias endometriales, que son difíciles o imposibles de analizar con el análisis de imágenes convencional, podría analizarse de forma fácil y precisa. Esta metodología se puede aplicar para caracterizar cuantitativamente el microambiente del endometrio, incluida la interacción entre las células inmunitarias, y su heterogeneidad para diferentes pacientes con insuficiencia reproductiva. La plataforma para la evaluación cuantitativa de las células inmunitarias endometriales puede tener una importancia clínica importante para el diagnóstico y el tratamiento de las pacientes con RM.

Recurrent miscarriage (RM) is the loss of two or more consecutive pregnancies and is a complex disease drawing attention from clinicians in recent years.The incidence rate of RM in women of childbearing age is 1%-5% 1. Results of previous studies show that immune factors are closely associated with the pathogenesis of RM2,3,4,5. Maintaining immune homeostasis at the maternal-fetal interface is required for embryo implantation and development. Endometrial immune cells perform several regulatory roles to maintain this homeostasis, such as promoting trophoblast invasion, remodeling spiral arteries, and contributing to placenta development6,7,8,9.
Aberrant endometrial immune cells in women with RM have previously been reported. Results show a close association between the high density of uterine natural killer cells (uNKs) and the occurrence of RM10,11,12. An increased number of macrophages has been reported in the endometrium of women with RM, compared with those who had a live birth13. Regulatory T cells (Treg) play a role in maternal immune tolerance toward the embryo, and their level and function are decreased in the decidua of RM patients14. Cytotoxicity T cells (CTL) and dendritic cells (DCs) also play a role in the immune regulation of pregnancy15,16. Therefore, a comprehensive quantitative analysis of local endometrial immune cells during the mid-luteal phase could help to better understand the pathogenesis of RM. Some current methods for quantitative analysis of endometrial immune cells use flow cytometry which can accurately label immune cells with multiple markers17,18. However, clinical application of flow cytometry is limited because it can only be performed on fresh tissue. Obtaining fresh tissue is only feasible when a large volume of excess tumor is available, a rare occurrence for endometrium. Immunohistochemistry can observe tissue morphology well in situ and can also label various immune cells, while traditional immunohistochemical techniques cannot perform quantitative analysis of immune cells.
Compared to conventional immunohistochemistry experiments, quantitative immunohistochemical analysis of immune cells in the endometrium has important clinical significance. IHC intensity scoring is usually ranked on a four-point scale or strong and weak in pathological diagnostics and research19,20,21. However, this semi-quantitative technique is subjective, highly inaccurate, and demonstrates significant intra-observer and inter-observer variability22. One possible solution is the application of machine learning, which is valuable indigital image analysis23,24. By providing quantitative measurements, this approach enables a more precise assessment of immune cell infiltration, distribution, and density within the uterine tissue. This quantitative information can help to elucidate the dynamic changes in immune cell populations during the menstrual cycle and in various pathological conditions. Overall, the ability to quantitatively analyze immune cells in the endometrium through immunohistochemistry offers valuable insights into the immune microenvironment of the uterus.
Therefore, the protocol aimed to developed and validated a digital immunohistochemistry image analysis platform to quantitatively analyze endometrial immune cells including uNK cells, Tregs, macrophages, DCs and cytotoxic T cells during the mid-luteal phase in RM patients.

Autor destacado: Avance de la inmunología reproductiva con un protocolo para la evaluación cuantitativa de células inmunitarias endometriales 

Plataforma para la detección cuantitativa de células inmunes endometriales basada en inmunohistoquímica y análisis de imágenes digitales

Currently, it is challenging to stabilize the analysis within a certain range. It is also difficult to maintain the quality control of the experiment. Our research can help the patients with abnormal endometrial sensitivity in immune to find the cause of reproductive failure.The local proportion of immune cells in the endometrial can be stably and repeatedly detected. Our findings may promote the research progress of the endometrial sensitivity evaluation in patients with repeated implantation failure.

Con el fin de evaluar cuantitativamente las células inmunitarias endometriales y reducir la inestabilidad causada por errores operativos provocados por el hombre, establecimos una plataforma de análisis cuantitativo digital para las células inmunitarias endometriales mediante el uso de la detección inmunohistoquímica automática y el sistema de evaluación cuantitativa digital. Se estableció la plataforma de análisis de imágenes inmunohistoquímicas para analizar cuantitativamente las células inmunes endometrial...

Watch this Scientific Journal Video about Advancing Reproductive Immunology with a Protocol for the Quantitative Evaluation of Endometrial Immune Cells at JoVE.com

Aquí, se desarrolló y validó una plataforma digital de análisis de imágenes inmunohistoquímicas para analizar cuantitativamente las células inmunitarias endometriales de pacientes con abortos espontáneos recurrentes en la ventana de implantación.

To evaluate the endometrial immune microenvironment of patients with recurrent miscarriage (RM), a digital immunohistochemistry image analysis platform ...

Actualmente, es difícil estabilizar el análisis dentro de un cierto rango. También es difícil mantener el control de calidad del experimento. Nuestra investigación puede ayudar a las pacientes con sensibilidad endometrial anormal en el sistema inmunológico a encontrar la causa del fracaso reproductivo.La proporción local de células inmunitarias en el endometrio se puede detectar de forma estable y repetida. Nuestros hallazgos pueden promover el progreso de la investigación de la evaluación de la sensibilidad endometrial en pacientes con fallo de implantación repetido.

platform-for-quantitative-detection-endometrial-immune-cells-based-on

Research

JoVE Journal

Biology

Platform for Quantitative Detection of Endometrial Immune Cells Based on Immunohistochemistry and Digital Image Analysis

757 vistas.  Shenzhen Zhongshan Urology Hospital. Actualmente, es difícil estabilizar el análisis dentro de un cierto rango. También es difícil mantener el control de calidad del experimento. Nuestra investigación puede ayudar a las pacientes con sensibilidad endometrial anormal en el sistema inmunológico a encontrar la causa del fracaso reproductivo.La proporción local de células inmunitarias en el endometrio se puede detectar de forma estable y repetida. Nuestros hallazgos pueden promover el progreso de la investigación de ...

Video: Autor destacado: Avance de la inmunología reproductiva con un protocolo para la evaluación cuantitativa de células inmunitarias endometriales 

To evaluate the endometrial immune microenvironment of patients with recurrent miscarriage (RM), a digital immunohistochemistry image analysis platform was developed and validated to quantitatively analyze endometrial immune cells during the mid-luteal phase. All endometrium samples were collected during the mid-luteal phase of the menstrual cycle. Paraffin-embedded endometrial tissues were sectioned into 4 &#181;m thick slides, and immunohistochemistry (IHC)staining was carried out for detecting endometrial immune cells, including CD56+ uNK cells, Foxp3+ Tregs, CD163+ M2 macrophages, CD1a+ DCs, and CD8+ T cells. The panoramic slides were scanned using a digital slide scanner and a commercial image analysis system was used for quantitative analysis. The percentage of endometrial immune cells was calculated by dividing the number of immune cells in the total endometrial cells. Using the commercial image analysis system, quantitative evaluation of endometrial immune cells, which are difficult or impossible to analyze with conventional image analysis, could be easily, and accurately analyzed. This methodology can be applied to quantitatively characterize the endometrium microenvironment, including interaction between immune cells, and its heterogeneity for different reproductive failure patients. The platform for quantitative evaluation of endometrial immune cells may be of important clinical significance for the diagnosis and treatment of RM patients.

Here, a digital immunohistochemistry image analysis platform was developed and validated to quantitatively analyze the endometrial immune cells of patients with recurrent miscarriages in the window of implantation.

Investigación

Biología

Dehydration of Human Endometrial Tissue for Sectioning

To begin, use tweezers to transfer the endometrial tissue from the formalin onto the embedding paper. With a ruler, measure the dimensions of the endometrial tissue. Now wrap the tissue in the embedding paper and place it into an embedding cassette.Transfer the cassette into the tissue basket for dehydration. To dehydrate the endometrial tissue, place the tissue basket in the reaction chamber of the dehydrator and initiate the procedure for routine tissue dehydration. Once the dehydration is complete, open the reaction chamber of the dehydrator and remove the tissue basket.

Deshidratación del tejido endometrial humano para seccionamiento

Human Endometrial Tissue Embedding and Sectioning for Immunohistochemistry and Digital Image Analysis

To begin, select an appropriate embedding mold that matches the size of the dehydrated endometrial specimen. Fill it with paraffin wax, heated at 70 degrees Celsius. Immediately place the dehydrated human endometrial tissue in the mold.Use forceps to carefully adjust the tissue, to ensure it is placed centrally. Now, transfer the mold to the cooling plate and gently press the tissue with tweezers as the paraffin at the bottom solidifies. Place the embedded cassette over the mold, and top it with more wax.Then place the mold back on the cooling plate. Once the paraffin has solidified completely, remove the block and its attached cassette from the mold. For sectioning, insert the block onto the sample clip of the microtome.Place the blade into the holder and adjust the angle between the blocks plane and the blade. Now adjust the thickness of the section to four micrometers. Then turn the hand wheel to start slicing.Cut thin sections from the block to expose the appropriate tissue surface. Use the brush to gather the continuous and complete sections. Once enough sections have been obtained, use tweezers to remove the unqualified sections at the front.With a brush, transfer the sections into a warm water bath, heated to 42 degrees Celsius. When the sections have fully flattened out, use anti detachment slides to lift them. Next, bake them in a slide warmer at 65 degrees Celsius for over 60 minutes before removing.

Inclusión y seccionamiento de tejido endometrial humano para inmunohistoquímica y análisis de imágenes digitales

Tissue Immunohistochemical Staining of Sectioned Human Endometrial Tissue

To begin, transfer the diluted antibody solution into a special reagent bottle. Insert the detection kit into the reagent compartment of an automatic immunohistochemical standing instrument. Next, set the slides with the sectioned endometrial tissue on a slide holder and cover them with a special cover tile.Then insert the holder into the experimental reaction compartment of the instrument. Once the instrument automatically recognizes the information on the reagent and slide, press the start button to initiate the immunohistochemical staining. After staining, take out the slide holder.Put the stained slide into the slide holder to wash off any remaining dye with clean water. Now, place the slide holder onto an automated cover slipper and run the dehydration and sealing procedure. Remove the slides once dehydration and sealing are complete.

Tinción inmunohistoquímica tisular de tejido endometrial humano seccionado

Tissue Scanning and Image Analysis of Immunohistochemically Stained Human Endometrium

To start, place the slides with the immunohistochemically stained endometrial sections on the slide rack of a panoramic pathological image scanner. Then, place the rack in the instrument's slide scanning compartment to initiate scanning. Once scanning is complete, launch the image analysis software and create a new folder.Import the images that require analysis. To build a tissue classifier, mark several tissues along with a blank annotation to establish a classifier that identifies the tissue and blank areas. Use realtime tuning to observe the software's recognition capacity during the mark annotation.To build an analysis algorithm, select the standard multiplex IHC algorithm in the software and choose the negative and positive pixels to set the color parameters of cell recognition. Establish the parameters of the nucleus, cytoplasm, and cell membrane until the optimal parameters for the image are found. Now, set the positive cell recognition threshold and optimize it until an appropriate threshold is obtained.Next, select the tissue classifier in the algorithm. Check the tissue part within it to identify cells based on tissues. Select the analysis area and then use the established algorithm to analyze the images.Once the analysis is complete, manually check the accuracy of tissue recognition, negative and positive recognition. If the image recognition is inaccurate, adjust the algorithm and parameter thresholds again. Run the image analysis until it is successful.Then, export the results of the analysis. Set the different analysis parameters according to the expression of different endometrial immune markers. Use the software to calculate the proportion of endometrial immune cells.Following calculation, use the values to assess the levels of various immune cells in the endometrium of patients with recurrent miscarriage. Different immune cells were immunohistochemically stained based on their individual expression of different markers. The brown stain represents the positive immune cells and the blue represents the nucleus.Different immune cells were expressed in women with recurrent miscarriages. CD56 cells appear to be predominant at 16.76%with CD1a and Foxp3 cells making up 0.11 to 0.12%of the immune cell population.