Os autores agradecem a todas as mulheres que consentiram e doaram amostras para este estudo.

O conteúdo e o protocolo da pesquisa foram eticamente revisados e aprovados pelo comitê de ética em pesquisa do Hospital de Urologia Zhongshan de Shenzhen. Todas as mulheres (20-40 anos) envolvidas no estudo assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido para coleta e utilização da amostra.
1. Aquisição de tecido patológico
<ol><li>Prepare as ferramentas para a colheita de tecidos, ou seja, régua de medição, tweezer, de incorporação, papel de incorporação e cesto de tecido.</li>
	<li>Observe se a quantidade de tecido endometrial (maior que um feijão mung), coletada por abordagem padrão com cateter pipelar, é suficiente.</li>
	<li>Transfira o tecido endometrial da formalina para o papel de incorporação com uma pinça e meça as dimensões do tecido endometrial com uma régua.</li>
	<li>Embrulhe o tecido endometrial com papel de incorporação e coloque em um de incorporação.</li>
	<li>Coloque o de incorporação no cesto de tecido para desidratação.</li>
</ol>2. Desidratação tecidual
<ol><li>Coloque o cesto de tecido na câmara de reação do desidratador (ver Tabela de Materiais) e inicie o procedimento de desidratação tecidual de rotina: formalina por 100 min; formalina por 100 min; álcool 75% por 60 min; álcool 85% por 60 min; álcool a 95% por 60 min; álcool 100% por 60 min; álcool 100% por 60 min; álcool 100% por 60 min; xileno por 35 min; xileno por 20 min; xileno por 20 min; cera por 80 min; cera por 80 min; cera por 80 min. O processo leva cerca de 15 h.</li>
	<li>No final do procedimento de desidratação do tecido, abra a câmara de reação do desidratador, remova a cesta de tecido.</li>
</ol>3. Incorporação de tecidos
<ol><li>Retire um molde de incorporação adequado de acordo com o tamanho do espécime e encha com cera de parafina a 70 ° C.</li>
	<li>Coloque rapidamente o tecido no molde e ajuste cuidadosamente para que o tecido esteja localizado no centro do molde.</li>
	<li>Mova o molde suavemente para a placa de resfriamento e pressione suavemente o tecido enquanto a parafina no fundo se fixa.</li>
	<li>Coloque o embutido em cima do molde e complemente com mais cera.</li>
	<li>Coloque o molde sobre a placa de resfriamento e, quando a parafina estiver completamente solidificada, retire o bloco com seu acoplado para longe do molde.</li>
</ol>4. Cortes de tecido
<ol><li>Insira o bloco no clipe de amostra do micrótomo, coloque a lâmina no suporte, ajuste o ângulo entre o plano do bloco e a lâmina, ajuste a espessura da seção para 4 μm, gire a roda manual e inicie o corte.</li>
	<li>Exponha a superfície apropriada do tecido cortando algumas seções finas do bloco. Retire as seções contínuas e completas com o pincel.</li>
	<li>Quando seções suficientes forem cortadas, pare de girar a roda manual, remova as seções não qualificadas na extremidade dianteira com uma pinça e flutue as seções na superfície de água a 42 °C no banho-maria com pinça e escova.</li>
	<li>Depois que as seções estiverem totalmente achatadas, escolha as seções em lâminas anti-descolamento e transfira para um aquecedor de lâminas a 65 °C para assar por 60 min.</li>
	<li>Quando o cozimento terminar, retire as lâminas de vidro do aquecedor de lâminas.</li>
</ol>5. Coloração imuno-histoquímica
<ol><li>Diluir o anticorpo primário numa solução funcional com diluente de anticorpos. Consulte a Tabela 1 para obter detalhes.</li>
	<li>Coloque a solução de anticorpos diluída num frasco especial de reagentes e o kit de detecção no compartimento de reagentes de um instrumento de coloração automática IHC (ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Coloque as lâminas em um suporte de corrediças, coberto com uma capa especial, e insira-as no compartimento de reação experimental do instrumento.</li>
	<li>Após o instrumento reconhecer automaticamente o reagente e as informações experimentais na lâmina, clique no botão Iniciar para iniciar a coloração imunohistoquímica. O experimento dura cerca de 3 h.</li>
</ol>6. Desidratação e vedação da lâmina
<ol><li>Após a coloração imunohistoquímica, retire o suporte da lâmina, retire a capa especial, coloque a lâmina manchada no suporte da lâmina e lave o corante restante na lâmina com água limpa.</li>
	<li>Transfira o suporte de corrediça para um deslizante de tampa automatizado (consulte Tabela de Materiais), selecione e execute o procedimento de desidratação e vedação.</li>
	<li>Retire as lâminas após a desidratação e selagem.</li>
</ol>7. Digitalização do slide
<ol><li>Coloque os slides no rack de slides do scanner de imagem patológica panorâmica (consulte Tabela de Materiais) e coloque-o no compartimento de digitalização de slides do instrumento para digitalização de imagem patológica panorâmica. A varredura leva 2 minutos. Veja a Figura 1.</li>
</ol>8. Análise das imagens
<ol><li>Importar imagem<ol><li>Abra o software de análise de imagens patológicas (consulte Tabela de Materiais) e crie uma nova pasta. Importar imagens imuno-histoquímicas a serem analisadas.</li>
	</ol></li>
	<li>Construir um classificador de tecidos<ol><li>Marque vários tecidos e anotações em branco para treinar e estabelecer um classificador para identificar o tecido e a área em branco, respectivamente.</li>
		<li>Use o ajuste em tempo real para observar a capacidade de reconhecimento do software em tempo real durante a anotação da marca. Se o reconhecimento não for oportuno, observe a anotação e treine novamente até que o reconhecimento do tecido seja preciso.</li>
	</ol></li>
	<li>Algoritmo de análise de compilação<ol><li>Selecione o algoritmo padrão no software de acordo com o tipo de experimento: multiplex IHC.</li>
		<li>Defina os parâmetros de cor do reconhecimento de célula selecionando pixels negativos e positivos típicos. Com base nisso, defina os parâmetros de núcleo, citoplasma e membrana celular, e observe a situação de reconhecimento celular em tempo real até encontrar os parâmetros mais adequados para a imagem.</li>
		<li>Defina o limiar de reconhecimento celular positivo e observe a situação de reconhecimento em tempo real até que o limiar apropriado seja ajustado.</li>
		<li>Selecione o classificador de tecido no algoritmo e verifique a parte de tecido no classificador de tecido, de modo a identificar células com base em tecidos. Neste ponto, o estabelecimento de um algoritmo de análise é concluído.</li>
	</ol></li>
	<li>Executar análise de imagem<ol><li>Selecione a área de análise. Use o algoritmo estabelecido para analisar imagens.</li>
	</ol></li>
	<li>Após a análise do software ter terminado de analisar, verifique manualmente se o reconhecimento da imagem é preciso, incluindo reconhecimento de tecido, reconhecimento celular negativo e positivo.</li>
	<li>Se o reconhecimento da imagem não for preciso, ajuste o algoritmo e o limite do parâmetro novamente e execute novamente a análise da imagem até obter êxito. Exportar os resultados da análise. Veja a Figura 1.</li>
	<li>Outras células imunes também podem ser analisadas de acordo com as etapas acima (ver Figura 1). Definir diferentes parâmetros de análise de acordo com a expressão real de diferentes marcadores imunes endometriais (células CD56+uNK, Foxp3+Tregs, macrófagos CD68+, macrófagos CD163+M2, CD1a+DC e células T CD8+25,26).</li>
	<li>Através do cálculo do software, obtém-se a proporção de células imunes endometriais (ver Tabela 2). Use isso para avaliar os níveis de várias células imunes no endométrio de pacientes com aborto espontâneo recorrente.</li>
</ol>

Análise de imagem do tecido endometrial corado imuno-histoquimicamente

<ol>
	<li>Practice Committee of the American Society for Reproductive. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+and+treatment+of+recurrent+pregnancy+loss:+a+committee+opinion.">Evaluation and treatment of recurrent pregnancy loss: a committee opinion.</a> Fertility and Sterility. 98 (5), 1103-1111 (2012).</li><li>Dimitriadis, E., Menkhorst, E., Saito, S., Kutteh, W. H., Brosens, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+pregnancy+loss.">Recurrent pregnancy loss.</a> Nature Reviews. 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Os autores não têm nada a revelar.

Este protocolo estabeleceu uma plataforma de análise de imagens de imuno-histoquímica digital para analisar quantitativamente células imunes endometriais de pacientes com RM. Aqui, seis marcadores imunes endometriais foram detectados para avaliar o microambiente imune endometrial em pacientes com RM.
Um endométrio receptivo durante a fase lútea média é fundamental para o sucesso da implantação e gravidez27,28. Portanto, a aval...

O aborto espontâneo recorrente (MR) é a perda de duas ou mais gestações consecutivas e é uma doença complexa que tem chamado a atenção dos clínicos nos últimos anos. A taxa de incidência de RM em mulheres em idade fértil é de 1%-5%1. Resultados de estudos prévios mostram que fatores imunológicos estão intimamente associados à patogênese da RM2,3,4,5. A manutenção da homeostase imune na interface materno-fetal é necessária para a implantação e desenvolvimento do embrião. As células imunes endometriais desempenham vários papéis regulatórios para manter essa homeostase, como promover a invasão do trofoblasto, remodelar as artérias espirais e contribuir para o desenvolvimento da placenta 6,7,8,9.
Células imunes endometriais aberrantes em mulheres com RM foram previamente relatadas. Os resultados mostram uma estreita associação entre a alta densidade de células natural killer uterinas (uNKs) e a ocorrência de RM10,11,12. Um número aumentado de macrófagos tem sido relatado no endométrio de mulheres com RM, em comparação com aquelas que tiveram um nascimento vivo13. As células T reguladoras (Treg) desempenham um papel na tolerância imunológica materna ao embrião, e seu nível e função estão diminuídos na decídua de pacientes com RM14. Citotoxicidade de células T (CTL) e células dendríticas (DCs) também desempenham um papel na regulação imunológica da gravidez15,16. Portanto, uma análise quantitativa abrangente das células imunes endometriais locais durante a fase lútea média poderia ajudar a entender melhor a patogênese da RM. Alguns métodos atuais para análise quantitativa de células imunes endometriais utilizam citometria de fluxo que pode marcar com precisão as células imunes com múltiplos marcadores17,18. No entanto, a aplicação clínica da citometria de fluxo é limitada, pois só pode ser realizada em tecido fresco. A obtenção de tecido fresco só é viável quando há grande volume de tumor em excesso, ocorrência rara no endométrio. A imuno-histoquímica pode observar bem a morfologia tecidual in situ e também pode marcar várias células imunes, enquanto as técnicas tradicionais de imuno-histoquímica não podem realizar análise quantitativa de células imunes.
Comparada aos experimentos convencionais de imunohistoquímica, a análise imunoistoquímica quantitativa das células imunes do endométrio tem importante significado clínico. O escore de intensidade da IHQ é geralmente classificado em uma escala de quatro pontos ou forte e fraco em diagnósticos patológicos e pesquisas 19,20,21. No entanto, essa técnica semiquantitativa é subjetiva, altamente imprecisa e demonstra significativa variabilidade intraobservador e interobservador22. Uma possível solução é a aplicação do aprendizado de máquina, que é valioso na análise de imagens digitais23,24. Ao fornecer medidas quantitativas, essa abordagem permite uma avaliação mais precisa da infiltração, distribuição e densidade de células imunes dentro do tecido uterino. Essas informações quantitativas podem ajudar a elucidar as mudanças dinâmicas nas populações de células imunes durante o ciclo menstrual e em várias condições patológicas. Em geral, a capacidade de analisar quantitativamente as células imunes no endométrio por meio da imunohistoquímica oferece informações valiosas sobre o microambiente imunológico do útero.
Portanto, o protocolo teve como objetivo desenvolver e validar uma plataforma de análise de imagens de imunohistoquímica digital para analisar quantitativamente células imunes endometriais, incluindo células uNK, Tregs, macrófagos, DCs e células T citotóxicas durante a fase lútea média em pacientes com RM.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Automated coverslipper</td>
			<td>Sakuraus</td>
			<td>DRS-Prisma-P-JCS&#38;Film-JC2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD163</td>
			<td>GrowGn Biotechnology</td>
			<td>NCL-L-CD163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD1a</td>
			<td>Gene Tech</td>
			<td>GM357129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD56</td>
			<td>Gene Tech</td>
			<td>GT200529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8</td>
			<td>Novocastra</td>
			<td>NCL-L-CD8-4B11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dehydrator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Excelsior ES</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital pathology and</td>
			<td>Indica labs</td>
			<td>HALO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foxp3</td>
			<td>YILIFANG biological</td>
			<td>14-477-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IHC stainer</td>
			<td>Leica</td>
			<td>BOND III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis platform</td>
			<td>Indica labs</td>
			<td>HALO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide Scanner</td>
			<td>Olympus life science</td>
			<td>VS200</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

platform for quantitative detection of endometrial immune cells based on immunohistochemistry and digital image analysis

Para avaliar o microambiente imune endometrial de pacientes com abortamento recorrente (RM), uma plataforma de análise de imagem imunoistoquímica digital foi desenvolvida e validada para analisar quantitativamente as células imunes endometriais durante a fase lútea média. Todas as amostras de endométrio foram coletadas durante a fase lútea média do ciclo menstrual. Os tecidos endometriais incluídos em parafina foram seccionados em lâminas de 4 μm de espessura, e a coloração imunoistoquímica (IHQ) foi realizada para detectar células imunes endometriais, incluindo células uNK CD56+, Tregs Foxp3+, macrófagos CD163+ M2, DCs CD1a+ e células T CD8+. As lâminas panorâmicas foram escaneadas por meio de um scanner digital de lâminas e um sistema comercial de análise de imagens foi utilizado para análise quantitativa. A porcentagem de células imunes endometriais foi calculada dividindo-se o número de células imunes nas células endometriais totais. Usando o sistema de análise de imagem comercial, a avaliação quantitativa de células imunes endometriais, que são difíceis ou impossíveis de analisar com a análise de imagem convencional, poderia ser analisada com facilidade e precisão. Esta metodologia pode ser aplicada para caracterizar quantitativamente o microambiente endométrio, incluindo a interação entre células imunes, e sua heterogeneidade para diferentes pacientes com falência reprodutiva. A plataforma para avaliação quantitativa de células imunes endometriais pode ser de importante importância clínica para o diagnóstico e tratamento de pacientes com RM.

Recurrent miscarriage (RM) is the loss of two or more consecutive pregnancies and is a complex disease drawing attention from clinicians in recent years.The incidence rate of RM in women of childbearing age is 1%-5% 1. Results of previous studies show that immune factors are closely associated with the pathogenesis of RM2,3,4,5. Maintaining immune homeostasis at the maternal-fetal interface is required for embryo implantation and development. Endometrial immune cells perform several regulatory roles to maintain this homeostasis, such as promoting trophoblast invasion, remodeling spiral arteries, and contributing to placenta development6,7,8,9.
Aberrant endometrial immune cells in women with RM have previously been reported. Results show a close association between the high density of uterine natural killer cells (uNKs) and the occurrence of RM10,11,12. An increased number of macrophages has been reported in the endometrium of women with RM, compared with those who had a live birth13. Regulatory T cells (Treg) play a role in maternal immune tolerance toward the embryo, and their level and function are decreased in the decidua of RM patients14. Cytotoxicity T cells (CTL) and dendritic cells (DCs) also play a role in the immune regulation of pregnancy15,16. Therefore, a comprehensive quantitative analysis of local endometrial immune cells during the mid-luteal phase could help to better understand the pathogenesis of RM. Some current methods for quantitative analysis of endometrial immune cells use flow cytometry which can accurately label immune cells with multiple markers17,18. However, clinical application of flow cytometry is limited because it can only be performed on fresh tissue. Obtaining fresh tissue is only feasible when a large volume of excess tumor is available, a rare occurrence for endometrium. Immunohistochemistry can observe tissue morphology well in situ and can also label various immune cells, while traditional immunohistochemical techniques cannot perform quantitative analysis of immune cells.
Compared to conventional immunohistochemistry experiments, quantitative immunohistochemical analysis of immune cells in the endometrium has important clinical significance. IHC intensity scoring is usually ranked on a four-point scale or strong and weak in pathological diagnostics and research19,20,21. However, this semi-quantitative technique is subjective, highly inaccurate, and demonstrates significant intra-observer and inter-observer variability22. One possible solution is the application of machine learning, which is valuable indigital image analysis23,24. By providing quantitative measurements, this approach enables a more precise assessment of immune cell infiltration, distribution, and density within the uterine tissue. This quantitative information can help to elucidate the dynamic changes in immune cell populations during the menstrual cycle and in various pathological conditions. Overall, the ability to quantitatively analyze immune cells in the endometrium through immunohistochemistry offers valuable insights into the immune microenvironment of the uterus.
Therefore, the protocol aimed to developed and validated a digital immunohistochemistry image analysis platform to quantitatively analyze endometrial immune cells including uNK cells, Tregs, macrophages, DCs and cytotoxic T cells during the mid-luteal phase in RM patients.

Autor em destaque: Avançando na imunologia reprodutiva com um protocolo para a avaliação quantitativa de células imunes endometriais 

Plataforma para Detecção Quantitativa de Células Imunes Endometriais Baseada em Imunohistoquímica e Análise Digital de Imagens

Currently, it is challenging to stabilize the analysis within a certain range. It is also difficult to maintain the quality control of the experiment. Our research can help the patients with abnormal endometrial sensitivity in immune to find the cause of reproductive failure.The local proportion of immune cells in the endometrial can be stably and repeatedly detected. Our findings may promote the research progress of the endometrial sensitivity evaluation in patients with repeated implantation failure.

A fim de avaliar quantitativamente as células imunes endometriais e reduzir a instabilidade causada por erros operacionais cometidos pelo homem, estabelecemos uma plataforma de análise quantitativa digital para células imunes endometriais usando detecção imunohistoquímica automática e sistema de avaliação quantitativa digital. Plataforma de análise de imagens imunoistoquímicas foi estabelecida para analisar quantitativamente células imunes endometriais de pacientes com abortamento recorrente (RM) na janela de...

Watch this Scientific Journal Video about Advancing Reproductive Immunology with a Protocol for the Quantitative Evaluation of Endometrial Immune Cells at JoVE.com

Aqui, uma plataforma de análise de imagens de imunohistoquímica digital foi desenvolvida e validada para analisar quantitativamente as células imunes endometriais de pacientes com abortos espontâneos recorrentes na janela de implantação.

To evaluate the endometrial immune microenvironment of patients with recurrent miscarriage (RM), a digital immunohistochemistry image analysis platform ...

Atualmente, é desafiador estabilizar a análise dentro de um determinado intervalo. Também é difícil manter o controle de qualidade do experimento. Nossa pesquisa pode ajudar as pacientes com sensibilidade endometrial anormal em imune a encontrar a causa da falha reprodutiva.A proporção local de células imunes no endométrio pode ser detectada de forma estável e repetida. Nossos achados podem promover o progresso da pesquisa da avaliação da sensibilidade endometrial em pacientes com falhas repetidas de implantação.

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Research

JoVE Journal

Biology

Platform for Quantitative Detection of Endometrial Immune Cells Based on Immunohistochemistry and Digital Image Analysis

744 visualizações.  Shenzhen Zhongshan Urology Hospital. Atualmente, é desafiador estabilizar a análise dentro de um determinado intervalo. Também é difícil manter o controle de qualidade do experimento. Nossa pesquisa pode ajudar as pacientes com sensibilidade endometrial anormal em imune a encontrar a causa da falha reprodutiva.A proporção local de células imunes no endométrio pode ser detectada de forma estável e repetida. Nossos achados podem promover o progresso da pesquisa da avaliação da sensibilidade endometrial em pacien...