저자들은 이 연구에 동의하고 샘플을 기증한 모든 여성들에게 감사한다.

연구 내용과 프로토콜은 Shenzhen Zhongshan Urology Hospital의 연구 윤리 위원회에서 윤리적으로 검토하고 승인했습니다. 연구에 참여한 모든 여성(20-40세)은 샘플 수집 및 사용에 대해 정보에 입각한 동의를 제공했습니다.
1. 병리조직의 획득
<ol><li>조직 채취를 위한 도구, 즉 측정 자, 핀셋, 임베딩 카세트, 임베딩 용지 및 티슈 바구니를 준비합니다.</li>
	<li>피펠 카테터와 함께 표준 접근법을 사용하여 수집된 자궁내막 조직(녹두보다 큼)의 양이 충분한지 관찰합니다.</li>
	<li>포르말린에서 자궁내막 조직을 핀셋으로 임베딩 페이퍼에 옮기고 자로 자궁내막 조직 치수를 측정합니다.</li>
	<li>자궁내막 조직을 임베딩 페이퍼로 감싸고 임베딩 카세트에 넣습니다.</li>
	<li>탈수를 위해 임베딩 카세트를 티슈 바스켓에 넣습니다.</li>
</ol>2. 조직 탈수
<ol><li>티슈 바스켓을 탈수기의 반응 챔버에 넣고 ( 재료 표 참조) 일상적인 조직 탈수 절차를 시작합니다 : 포르말린 100 분; 100분 동안 포르말린; 60분 동안 75% 알코올; 60분 동안 85% 알코올; 60분 동안 95% 알코올; 60분 동안 100% 알코올; 60분 동안 100% 알코올; 60분 동안 100% 알코올; 35분 동안 크실렌; 20분 동안 크실렌; 20분 동안 크실렌; 80 분 동안 왁스; 80 분 동안 왁스; 80분 동안 왁스를 바릅니다. 이 과정은 약 15 시간이 걸립니다.</li>
	<li>조직 탈수 절차가 끝나면 탈수기의 반응 챔버를 열고 티슈 바스켓을 제거합니다.</li>
</ol>3. 조직 임베딩
<ol><li>시편의 크기에 따라 적절한 매립 금형을 꺼내 70°C에서 파라핀 왁스를 채운다.</li>
	<li>티슈를 몰드에 빠르게 넣고 티슈가 몰드 중앙에 오도록 조심스럽게 조정합니다.</li>
	<li>금형을 냉각판으로 부드럽게 옮기고 바닥의 파라핀이 굳는 동안 티슈를 부드럽게 누릅니다.</li>
	<li>몰드 위에 임베딩 카세트를 놓고 왁스를 더 얹습니다.</li>
	<li>냉각판에 금형을 놓고 파라핀이 완전히 응고되면 부착된 카세트가 있는 블록을 금형에서 제거합니다.</li>
</ol>4. 조직 단면
<ol><li>마이크로톰의 샘플 클립에 블록을 삽입하고 블레이드를 홀더에 놓고 블록 평면과 블레이드 사이의 각도를 조정하고 단면의 두께를 4μm로 조정하고 핸드 휠을 돌리고 슬라이싱을 시작합니다.</li>
	<li>블록에서 몇 개의 얇은 부분을 잘라 적절한 조직 표면을 노출시킵니다. 브러시로 연속적이고 완전한 섹션을 꺼냅니다.</li>
	<li>단면이 충분히 절단되면 핸드 휠을 돌리는 것을 멈추고 핀셋으로 앞쪽 끝의 부적격 단면을 제거하고 핀셋과 브러시로 수조의 42°C 물 표면에 단면을 띄웁니다.</li>
	<li>섹션이 완전히 평평해지면 분리 방지 슬라이드에서 섹션을 선택하고 65°C의 슬라이드 워머로 옮겨 60분 동안 굽습니다.</li>
	<li>베이킹이 끝나면 슬라이드 워머에서 유리 슬라이드를 꺼냅니다.</li>
</ol>5. 면역조직화학적 염색
<ol><li>1차 항체를 항체 희석제가 있는 작업 용액에 희석합니다. 자세한 내용은 표 1 을 참조하십시오.</li>
	<li>희석된 항체 용액을 특수 시약 병에 넣고 검출 키트를 자동 IHC 염색기의 시약 구획에 넣습니다( 재료 표 참조).</li>
	<li>특수 커버타일로 덮인 슬라이드 홀더에 슬라이드를 놓고 기기의 실험 반응 구획에 삽입합니다.</li>
	<li>기기가 슬라이드의 시약 및 실험 정보를 자동으로 인식한 후 시작 버튼을 클릭하여 면역조직화학적 염색을 시작합니다. 실험은 약 3시간 동안 지속됩니다.</li>
</ol>6. 활주의 탈수함 그리고 바다표범 어업
<ol><li>면역조직화학적 염색 후 슬라이드 홀더를 꺼내고 특수 커버타일을 제거하고 염색된 슬라이드를 슬라이드 홀더에 넣고 슬라이드에 남아 있는 염료를 깨끗한 물로 씻어냅니다.</li>
	<li>슬라이드 홀더를 자동 커버슬리퍼( 재료 표 참조)로 옮기고 탈수 및 밀봉 절차를 선택하고 실행합니다.</li>
	<li>탈수 및 밀봉 후 슬라이드를 꺼냅니다.</li>
</ol>7. 슬라이드 스캔
<ol><li>슬라이드를 파노라마 병리학적 이미지 스캐너의 슬라이드 랙에 놓고( 재료 표 참조) 파노라마 병리학적 이미지 스캔을 위해 기기 슬라이드 스캔 구획에 놓습니다. 스캔하는 데 2분이 걸립니다. 그림 1을 참조하십시오.</li>
</ol>8. 이미지 분석
<ol><li>이미지 가져오기<ol><li>병리학적 이미지 분석 소프트웨어( 재료 표 참조)를 열고 새 폴더를 만듭니다. 분석할 면역조직화학적 이미지를 가져옵니다.</li>
	</ol></li>
	<li>조직 분류기 구축<ol><li>여러 조직과 빈 주석을 표시하여 조직과 빈 영역을 각각 식별하기 위한 분류기를 훈련하고 설정합니다.</li>
		<li>실시간 튜닝을 사용하여 마크 주석을 추가하는 동안 소프트웨어의 인식 용량을 실시간으로 관찰할 수 있습니다. 인식이 적시에 이루어지지 않으면 주석을 달고 조직 인식이 정확해질 때까지 다시 훈련하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>분석 알고리즘 구축<ol><li>실험 유형에 따라 소프트웨어에서 표준 알고리즘을 선택하십시오 : 멀티플렉스 IHC.</li>
		<li>셀 인식의 색상 매개변수는 일반적인 음수 및 양수 픽셀을 선택하여 설정합니다. 이를 기반으로 핵, 세포질, 세포막의 파라미터를 설정하고, 이미지에 가장 적합한 파라미터를 찾을 때까지 실시간으로 세포 인식 상황을 관찰합니다.</li>
		<li>양성 세포 인식 임계값을 설정하고 적절한 임계값이 조정될 때까지 실시간으로 인식 상황을 관찰합니다.</li>
		<li>알고리즘에서 조직 분류기를 선택하고 조직 분류기에서 조직 부분을 확인하여 조직을 기반으로 세포를 식별합니다. 이 시점에서 분석 알고리즘 설정이 완료됩니다.</li>
	</ol></li>
	<li>이미지 분석 실행<ol><li>분석 영역을 선택합니다. 설정된 알고리즘을 사용하여 이미지를 분석합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>소프트웨어 분석이 완료되면 조직 인식, 음성 및 양성 세포 인식을 포함하여 이미지 인식이 정확한지 수동으로 확인합니다.</li>
	<li>이미지 인식이 정확하지 않으면 알고리즘과 파라미터 임계값을 다시 조정하고 성공할 때까지 이미지 분석을 다시 실행합니다. 분석 결과를 내보냅니다. 그림 1을 참조하십시오.</li>
	<li>위의 단계에 따라 다른 면역 세포도 분석할 수 있습니다(그림 1 참조). 다양한 자궁내막 면역 마커(CD56+uNK 세포, Foxp3+Tregs, CD68+ 대식세포, CD163+M2 대식세포, CD1a+DC 및 CD8+T 세포25,26)의 실제 발현에 따라 다양한 분석 파라미터를 설정합니다.</li>
	<li>소프트웨어의 계산을 통해 자궁내막 면역 세포의 비율을 얻습니다( 표 2 참조). 이를 사용하여 재발성 유산 환자의 자궁내막에 있는 다양한 면역 세포의 수준을 평가합니다.</li>
</ol>

면역조직화학적으로 염색된 자궁내막 조직의 이미지 분석

<ol>
	<li>Practice Committee of the American Society for Reproductive. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+and+treatment+of+recurrent+pregnancy+loss:+a+committee+opinion.">Evaluation and treatment of recurrent pregnancy loss: a committee opinion.</a> Fertility and Sterility. 98 (5), 1103-1111 (2012).</li><li>Dimitriadis, E., Menkhorst, E., Saito, S., Kutteh, W. H., Brosens, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+pregnancy+loss.">Recurrent pregnancy loss.</a> Nature Reviews. Disease Primers. 6 (1), 98 (2020).</li><li>Kavvadas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+Evaluation+of+CD3,+CD4,+CD8,+and+CD20+in+Decidual+and+Trophoblastic+Tissue+Specimens+of+Patients+with+Recurrent+Pregnancy+Loss.">Immunohistochemical Evaluation of CD3, CD4, CD8, and CD20 in Decidual and Trophoblastic Tissue Specimens of Patients with Recurrent Pregnancy Loss.</a> 12 (2), 177-193 (2022).</li><li>Arora, R., Rathee, A., Sachdeva, M., Agrawal, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unexplained+repeated+pregnancy+loss+and+T+helper+cells.">Unexplained repeated pregnancy loss and T helper cells.</a> European Journal of Obstetrics, Gynecology, and Reproductive Biology. 254, 277-283 (2020).</li><li>Du, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+percentage+of+CD3(+)T+cells+and+pregnancy+outcome+in+women+with+recurrent+pregnancy+loss.">Elevated percentage of CD3(+)T cells and pregnancy outcome in women with recurrent pregnancy loss.</a> Clinica Chimica Acta. 486, 341-346 (2018).</li><li>Faas, M. M., de Vos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uterine+NK+cells+and+macrophages+in+pregnancy.">Uterine NK cells and macrophages in pregnancy.</a> Placenta. 56, 44-52 (2017).</li><li>Huppertz, B., Berghold, V. M., Kawaguchi, R., Gauster, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+variety+of+opportunities+for+immune+interactions+during+trophoblast+development+and+invasion.">A variety of opportunities for immune interactions during trophoblast development and invasion.</a> American Journal of Reproductive Immunology. 67 (5), 349-357 (2012).</li><li>Meyer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chymase-producing+cells+of+the+innate+immune+system+are+required+for+decidual+vascular+remodeling+and+fetal+growth.">Chymase-producing cells of the innate immune system are required for decidual vascular remodeling and fetal growth.</a> Scientific Reports. 7, 45106 (2017).</li><li>Smith, S. D., Dunk, C. E., Aplin, J. D., Harris, L. K., Jones, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+immune+cell+involvement+in+decidual+spiral+arteriole+remodeling+in+early+human+pregnancy.">Evidence for immune cell involvement in decidual spiral arteriole remodeling in early human pregnancy.</a> American Journal of Pathology. 174 (5), 1959-1971 (2009).</li><li>Clifford, K., Flanagan, A. M., Regan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endometrial+CD56++natural+killer+cells+in+women+with+recurrent+miscarriage:+a+histomorphometric+study.">Endometrial CD56+ natural killer cells in women with recurrent miscarriage: a histomorphometric study.</a> Human Reproduction. 14 (11), 2727-2730 (1999).</li><li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+uterine+natural+killer+cell+percentage+in+the+periimplantation+endometrium+from+fertile+women+and+women+with+recurrent+reproductive+failure:+establishment+of+a+reference+range.">Measurement of uterine natural killer cell percentage in the periimplantation endometrium from fertile women and women with recurrent reproductive failure: establishment of a reference range.</a> American Journal of Obstetrics and Gynecology. 217 (6), 680 e1-680 e6 (2017).</li><li>Tuckerman, E., Mariee, N., Prakash, A., Li, T. C., Laird, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uterine+natural+killer+cells+in+peri-implantation+endometrium+from+women+with+repeated+implantation+failure+after+IVF.">Uterine natural killer cells in peri-implantation endometrium from women with repeated implantation failure after IVF.</a> Journal of Reproductive Immunology. 87 (1-2), 60-66 (2010).</li><li>Laird, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+immune+cells+and+molecules+in+women+with+recurrent+miscarriage.">A review of immune cells and molecules in women with recurrent miscarriage.</a> Human Reproduction Update. 9 (2), 163-174 (2003).</li><li>Keller, C. C., Eikmans, M., van der Hoorn, M. P., Lashley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+miscarriages+and+the+association+with+regulatory+T+cells;+A+systematic+review.">Recurrent miscarriages and the association with regulatory T cells; A systematic review.</a> Journal of Reproductive Immunology. 139, 103105 (2020).</li><li>Vallv&#233;-Juanico, J., Houshdaran, S., Giudice, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endometrial+immune+environment+of+women+with+endometriosis.">The endometrial immune environment of women with endometriosis.</a> Human Reproduction Update. 25 (5), 564-591 (2019).</li><li>Yang, F., Zheng, Q., Jin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Function+and+Composition+Changes+of+Immune+Cells+During+Normal+and+Pathological+Pregnancy+at+the+Maternal-Fetal+Interface.">Dynamic Function and Composition Changes of Immune Cells During Normal and Pathological Pregnancy at the Maternal-Fetal Interface.</a> Frontiers in Immunology. 10, 2317 (2019).</li><li>Hey-Cunningham, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+analysis+utilizing+flow+cytometry+and+immunohistochemistry+reveals+inflammatory+changes+in+local+endometrial+and+systemic+dendritic+cell+populations+in+endometriosis.">Comprehensive analysis utilizing flow cytometry and immunohistochemistry reveals inflammatory changes in local endometrial and systemic dendritic cell populations in endometriosis.</a> Human Reproduction. 36 (2), 415-428 (2021).</li><li>Zhong, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+Immune+Infiltration+in+Endometriosis+and+Their+Relationship+to+r-AFS+Stages.">Patterns of Immune Infiltration in Endometriosis and Their Relationship to r-AFS Stages.</a> Frontiers in Genetics. 12, 631715 (2021).</li><li>Attems, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropathological+consensus+criteria+for+the+evaluation+of+Lewy+pathology+in+post-mortem+brains:+a+multi-centre+study.">Neuropathological consensus criteria for the evaluation of Lewy pathology in post-mortem brains: a multi-centre study.</a> Acta Neuropathologic. 141 (2), 159-172 (2021).</li><li>Kovacs, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multisite+Assessment+of+Aging-Related+Tau+Astrogliopathy+(ARTAG).">Multisite Assessment of Aging-Related Tau Astrogliopathy (ARTAG).</a> Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 76 (7), 605-619 (2017).</li><li>Modis, L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+changes+in+corneal+opacification+vary+depending+on+etiology.">Extracellular matrix changes in corneal opacification vary depending on etiology.</a> Molecular Vision. 27, 26-36 (2021).</li><li>Walker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+immunohistochemistry--issues+concerning+methods,+utility+and+semiquantitative+assessment+I.">Quantification of immunohistochemistry--issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment I.</a> Histopathology. 49 (4), 406-410 (2006).</li><li>Jensen, K., Krusenstjerna-Hafstrom, R., Lohse, J., Petersen, K. H., Derand, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+quantitative+immunohistochemistry+method+for+precise+protein+measurements+directly+in+formalin-fixed,+paraffin-embedded+specimens:+analytical+performance+measuring+HER2.">A novel quantitative immunohistochemistry method for precise protein measurements directly in formalin-fixed, paraffin-embedded specimens: analytical performance measuring HER2.</a> Modern Pathology. 30 (2), 180-193 (2017).</li><li>Moreno-Ruiz, P., Wik Leiss, L., Mezheyeuski, A., Ehnman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+Immunohistochemistry+and+Digital+Image+Analysis.">Double Immunohistochemistry and Digital Image Analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 1913, 3-11 (2019).</li><li>Li, D., Zheng, L., Zhao, D., Xu, Y., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Immune+Cells+in+Recurrent+Spontaneous+Abortion.">The Role of Immune Cells in Recurrent Spontaneous Abortion.</a> Reproductive Sciences. 28 (12), 3303-3315 (2021).</li><li>Diao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+endometrial+immune+cell-based+score+(EI-score)+for+the+prediction+of+implantation+success+for+patients+undergoing+IVF/ICSI.">New endometrial immune cell-based score (EI-score) for the prediction of implantation success for patients undergoing IVF/ICSI.</a> Placenta. 99, 180-188 (2020).</li><li>Hewitt, S. C., Korach, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology.+A+hand+to+support+the+implantation+window.">Cell biology. A hand to support the implantation window.</a> Science. 331 (6019), 863-864 (2011).</li><li>Afshar, Y., Stanculescu, A., Miele, L., Fazleabas, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+chorionic+gonadotropin+and+Notch1+in+implantation.">The role of chorionic gonadotropin and Notch1 in implantation.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 24 (7), 296-302 (2007).</li><li>Tan, W. C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+multiplex+immunohistochemistry/immunofluorescence+techniques+in+the+era+of+cancer+immunotherapy.">Overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy.</a> Cancer Communication (London,England). 40 (4), 135-153 (2020).</li><li>Algars, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+and+location+of+tumor-infiltrating+macrophages+and+lymphatic+vessels+predict+survival+of+colorectal+cancer+patients.">Type and location of tumor-infiltrating macrophages and lymphatic vessels predict survival of colorectal cancer patients.</a> International Journal of Cancer. 131 (4), 864-873 (2012).</li><li>Carey, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topological+analysis+reveals+a+PD-L1-associated+microenvironmental+niche+for+Reed-Sternberg+cells+in+Hodgkin+lymphoma.">Topological analysis reveals a PD-L1-associated microenvironmental niche for Reed-Sternberg cells in Hodgkin lymphoma.</a> Blood. 130 (22), 2420-2430 (2017).</li><li>Ascierto, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+Mechanisms+of+Resistance+to+Anti-PD-1+Therapy.">Transcriptional Mechanisms of Resistance to Anti-PD-1 Therapy.</a> Clinical Cancer Research. 23 (12), 3168-3180 (2017).</li><li>O'Rourke, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+dose+of+peripherally+infused+EGFRvIII-directed+CAR+T+cells+mediates+antigen+loss+and+induces+adaptive+resistance+in+patients+with+recurrent+glioblastoma.">A single dose of peripherally infused EGFRvIII-directed CAR T cells mediates antigen loss and induces adaptive resistance in patients with recurrent glioblastoma.</a> Science Translational Medicine. 9 (399), eaaa0984 (2017).</li><li>Canesin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+with+the+WNT5A-mimicking+peptide+Foxy-5+effectively+reduces+the+metastatic+spread+of+WNT5A-low+prostate+cancer+cells+in+an+orthotopic+mouse+model.">Treatment with the WNT5A-mimicking peptide Foxy-5 effectively reduces the metastatic spread of WNT5A-low prostate cancer cells in an orthotopic mouse model.</a> PLoS One. 12 (9), e0184418 (2017).</li></ol>

저자는 공개할 것이 없습니다.

이 프로토콜은 RM 환자의 자궁내막 면역세포를 정량적으로 분석하기 위한 디지털 면역조직화학 영상 분석 플랫폼을 구축했습니다. 여기에서 RM 환자의 자궁내막 면역 미세환경을 평가하기 위해 6개의 자궁내막 면역 마커를 검출했습니다.
황체 중기의 수용성 자궁내막은 성공적인 착상과 임신의 핵심이다27,28. 따라서 자궁내막 면역?...

재발성 유산(RM)은 두 번 이상의 연속적인 임신을 상실하는 것으로, 최근 몇 년 동안 임상의들의 관심을 끌고 있는 복잡한 질병입니다. 가임기 여성의 RM 발생률은 1%-5%입니다 1. 이전 연구의 결과는 면역 요인이 RM 2,3,4,5의 발병과 밀접한 관련이 있음을 보여줍니다. 모체-태아 계면에서 면역 항상성을 유지하는 것은 배아 착상과 발달에 필요합니다. 자궁내막 면역세포는 영양세포 침범 촉진, 나선형 동맥 개조, 태반 발달에 기여하는 등 이러한 항상성을 유지하기 위해 여러 가지 조절 역할을 수행합니다 6,7,8,9.
RM이 있는 여성의 비정상적인 자궁내막 면역 세포는 이전에 보고된 바 있습니다. 결과는 자궁 자연 살해 세포(uNK)의 고밀도와 RM10,11,12의 발생 사이에 밀접한 연관성이 있음을 보여줍니다. RM을 가진 여성의 자궁내막에서 대식세포의 수가 증가한 것으로 보고되었는데, 이는 출산을 한 여성에 비해 증가한 수치이다13. 조절 T 세포(Treg)는 배아에 대한 모계의 면역 관용에 중요한 역할을 하며, RM 환자의 데시두아에서 그 수준과 기능이 감소한다14. 세포독성 T 세포(CTL)와 수지상 세포(DC)도 임신의 면역 조절에 중요한 역할을 합니다15,16. 따라서 황체 중기 동안 국소 자궁내막 면역 세포에 대한 포괄적인 정량 분석은 RM의 발병 기전을 더 잘 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. 자궁내막 면역 세포의 정량적 분석을 위한 일부 현재 방법은 여러 마커를 가진 면역 세포를 정확하게 표지할 수 있는 유세포 분석을 사용합니다17,18. 그러나 유세포 분석의 임상적 적용은 신선한 조직에서만 수행할 수 있기 때문에 제한적입니다. 신선한 조직을 얻는 것은 자궁내막에서 드물게 발생하는 많은 양의 과도한 종양을 사용할 수 있을 때만 가능합니다. 면역조직화학은 조직 형태를 현장에서 잘 관찰할 수 있고 다양한 면역 세포를 표지할 수 있는 반면, 기존의 면역조직화학 기법은 면역 세포의 정량 분석을 수행할 수 없습니다.
기존의 면역조직화학 실험과 비교했을 때, 자궁내막의 면역세포에 대한 정량적 면역조직화학적 분석은 임상적으로 중요한 의미를 지닙니다. IHC 강도 점수는 일반적으로 병리학적 진단 및 연구에서 4점 척도 또는 강하고 약한 것으로 평가됩니다 19,20,21. 그러나 이 반정량적 기법은 주관적이고, 매우 부정확하며, 관찰자 내 및 관찰자 간 변동성이 크다22. 한 가지 가능한 해결책은 기계 학습의 적용이며, 이는 디지털 이미지 분석에서 가치 있는 것입니다23,24. 정량적 측정을 제공함으로써 이 접근법은 자궁 조직 내 면역 세포 침투, 분포 및 밀도를 보다 정확하게 평가할 수 있습니다. 이 정량적 정보는 월경 주기 및 다양한 병리학적 조건에서 면역 세포 집단의 동적 변화를 설명하는 데 도움이 될 수 있습니다. 전반적으로, 면역조직화학을 통해 자궁내막의 면역세포를 정량적으로 분석할 수 있는 능력은 자궁의 면역 미세환경에 대한 귀중한 통찰력을 제공합니다.
따라서 이 프로토콜은 RM 환자의 황체 중기 동안 uNK 세포, Tregs, 대식세포, DC 및 세포독성 T 세포를 포함한 자궁내막 면역 세포를 정량적으로 분석하기 위한 디지털 면역조직화학 이미지 분석 플랫폼을 개발하고 검증하는 것을 목표로 했습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Automated coverslipper</td>
			<td>Sakuraus</td>
			<td>DRS-Prisma-P-JCS&#38;Film-JC2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD163</td>
			<td>GrowGn Biotechnology</td>
			<td>NCL-L-CD163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD1a</td>
			<td>Gene Tech</td>
			<td>GM357129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD56</td>
			<td>Gene Tech</td>
			<td>GT200529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8</td>
			<td>Novocastra</td>
			<td>NCL-L-CD8-4B11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dehydrator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Excelsior ES</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital pathology and</td>
			<td>Indica labs</td>
			<td>HALO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foxp3</td>
			<td>YILIFANG biological</td>
			<td>14-477-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IHC stainer</td>
			<td>Leica</td>
			<td>BOND III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis platform</td>
			<td>Indica labs</td>
			<td>HALO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide Scanner</td>
			<td>Olympus life science</td>
			<td>VS200</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

platform for quantitative detection of endometrial immune cells based on immunohistochemistry and digital image analysis

재발성 유산(RM) 환자의 자궁내막 면역 미세환경을 평가하기 위해 황체 중기 동안 자궁내막 면역세포를 정량적으로 분석할 수 있는 디지털 면역조직화학 영상 분석 플랫폼을 개발 및 검증했습니다. 모든 자궁내막 샘플은 월경 주기의 황체 중기에 수집되었습니다. 파라핀이 포매된 자궁내막 조직을 4μm 두께의 슬라이드로 절단하고, CD56+ uNK 세포, Foxp3+ Tregs, CD163+ M2 대식세포, CD1a+ DC, CD8+ T 세포를 포함한 자궁내막 면역 세포를 검출하기 위해 면역조직화학(IHC) 염색을 수행했습니다. 파노라마 슬라이드는 디지털 슬라이드 스캐너를 사용하여 스캔했으며 정량 분석을 위해 상용 이미지 분석 시스템을 사용했습니다. 자궁내막 면역세포의 비율은 전체 자궁내막세포의 면역세포 수를 나누어 계산하였다. 상용 영상 분석 시스템을 이용하면 기존의 영상 분석으로는 분석이 어렵거나 불가능했던 자궁내막 면역세포의 정량 평가를 쉽고 정확하게 분석할 수 있습니다. 이 방법론은 면역 세포 간의 상호 작용과 다양한 생식 부전 환자에 대한 이질성을 포함하여 자궁 내막 미세 환경을 정량적으로 특성화하는 데 적용할 수 있습니다. 자궁내막 면역 세포의 정량적 평가를 위한 플랫폼은 RM 환자의 진단 및 치료에 중요한 임상적 중요성을 가질 수 있습니다.

Recurrent miscarriage (RM) is the loss of two or more consecutive pregnancies and is a complex disease drawing attention from clinicians in recent years.The incidence rate of RM in women of childbearing age is 1%-5% 1. Results of previous studies show that immune factors are closely associated with the pathogenesis of RM2,3,4,5. Maintaining immune homeostasis at the maternal-fetal interface is required for embryo implantation and development. Endometrial immune cells perform several regulatory roles to maintain this homeostasis, such as promoting trophoblast invasion, remodeling spiral arteries, and contributing to placenta development6,7,8,9.
Aberrant endometrial immune cells in women with RM have previously been reported. Results show a close association between the high density of uterine natural killer cells (uNKs) and the occurrence of RM10,11,12. An increased number of macrophages has been reported in the endometrium of women with RM, compared with those who had a live birth13. Regulatory T cells (Treg) play a role in maternal immune tolerance toward the embryo, and their level and function are decreased in the decidua of RM patients14. Cytotoxicity T cells (CTL) and dendritic cells (DCs) also play a role in the immune regulation of pregnancy15,16. Therefore, a comprehensive quantitative analysis of local endometrial immune cells during the mid-luteal phase could help to better understand the pathogenesis of RM. Some current methods for quantitative analysis of endometrial immune cells use flow cytometry which can accurately label immune cells with multiple markers17,18. However, clinical application of flow cytometry is limited because it can only be performed on fresh tissue. Obtaining fresh tissue is only feasible when a large volume of excess tumor is available, a rare occurrence for endometrium. Immunohistochemistry can observe tissue morphology well in situ and can also label various immune cells, while traditional immunohistochemical techniques cannot perform quantitative analysis of immune cells.
Compared to conventional immunohistochemistry experiments, quantitative immunohistochemical analysis of immune cells in the endometrium has important clinical significance. IHC intensity scoring is usually ranked on a four-point scale or strong and weak in pathological diagnostics and research19,20,21. However, this semi-quantitative technique is subjective, highly inaccurate, and demonstrates significant intra-observer and inter-observer variability22. One possible solution is the application of machine learning, which is valuable indigital image analysis23,24. By providing quantitative measurements, this approach enables a more precise assessment of immune cell infiltration, distribution, and density within the uterine tissue. This quantitative information can help to elucidate the dynamic changes in immune cell populations during the menstrual cycle and in various pathological conditions. Overall, the ability to quantitatively analyze immune cells in the endometrium through immunohistochemistry offers valuable insights into the immune microenvironment of the uterus.
Therefore, the protocol aimed to developed and validated a digital immunohistochemistry image analysis platform to quantitatively analyze endometrial immune cells including uNK cells, Tregs, macrophages, DCs and cytotoxic T cells during the mid-luteal phase in RM patients.

저자 스포트라이트: 자궁내막 면역 세포의 정량적 평가를 위한 프로토콜을 통한 생식 면역학 발전(Advancing Reproductive Immunology with a Protocol for the Quantitative Evaluation of Endometrial Immune Cells) 

면역조직화학(immunohistochemistry) 및 디지털 이미지 분석(Digital Image Analysis)을 기반으로 한 자궁내막 면역세포의 정량적 검출을 위한 플랫폼

Currently, it is challenging to stabilize the analysis within a certain range. It is also difficult to maintain the quality control of the experiment. Our research can help the patients with abnormal endometrial sensitivity in immune to find the cause of reproductive failure.The local proportion of immune cells in the endometrial can be stably and repeatedly detected. Our findings may promote the research progress of the endometrial sensitivity evaluation in patients with repeated implantation failure.

자궁내막 면역세포를 정량적으로 평가하고 인위적인 조작 실수로 인한 불안정성을 줄이기 위해 자동 면역조직화학적 검출 및 디지털 정량 평가 시스템을 사용하여 자궁내막 면역세포에 대한 디지털 정량 분석 플랫폼을 구축했습니다. 이식 기간 동안 재발성 유산(RM) 환자의 자궁내막 면역세포를 정량적으로 분석하기 위해 면역조직화학 영상 분석 플랫폼을 구축하였습니다. 모든 자궁내막 조직은...

Watch this Scientific Journal Video about Advancing Reproductive Immunology with a Protocol for the Quantitative Evaluation of Endometrial Immune Cells at JoVE.com

여기에서 디지털 면역조직화학 영상 분석 플랫폼을 개발하여 착상 기간 동안 유산이 재발한 환자의 자궁내막 면역세포를 정량적으로 분석할 수 있도록 검증했습니다.

To evaluate the endometrial immune microenvironment of patients with recurrent miscarriage (RM), a digital immunohistochemistry image analysis platform ...

현재로서는 특정 범위 내에서 분석을 안정화하는 것이 어렵습니다. 실험의 품질 관리를 유지하는 것도 어렵습니다. 우리의 연구는 면역력에서 비정상적인 자궁내막 민감도를 가진 환자가 생식 부전의 원인을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다.자궁내막에서 면역세포의 국소적 비율을 안정적이고 반복적으로 검출할 수 있습니다. 우리의 발견은 반복적인 착상 실패 환자에 대한 자궁내막 민감도 평가의 연구 진행을 촉진할 수 있습니다.

platform-for-quantitative-detection-endometrial-immune-cells-based-on

Research

JoVE Journal

Biology

Platform for Quantitative Detection of Endometrial Immune Cells Based on Immunohistochemistry and Digital Image Analysis

754 조회수.  Shenzhen Zhongshan Urology Hospital. 현재로서는 특정 범위 내에서 분석을 안정화하는 것이 어렵습니다. 실험의 품질 관리를 유지하는 것도 어렵습니다. 우리의 연구는 면역력에서 비정상적인 자궁내막 민감도를 가진 환자가 생식 부전의 원인을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다.자궁내막에서 면역세포의 국소적 비율을 안정적이고 반복적으로 검출할 수 있습니다. 우리의 발견은 반복적인 착상 실패 환자에 ...

비디오: 저자 스포트라이트: 자궁내막 면역 세포의 정량적 평가를 위한 프로토콜을 통한 생식 면역학 발전(Advancing Reproductive Immunology with a Protocol for the Quantitative Evaluation of Endometrial Immune Cells) 