Este trabajo fue financiado por NIH R21AG059117 y los Laboratorios Paul F. Glenn para la Investigación de la Biología del Envejecimiento de la Universidad de Michigan. SB fue financiado por T32AG000114. ESK fue financiado por NSF DGE 1841052.

1. Inoculación de bacterias
<ol><li>Preparar caldo de Luria (LB) disolviendo 10 g de triptona, 5 g de extracto de levadura y 10 g de cloruro de sodio (NaCl) en 950 mL de agua destilada.</li>
	<li>Ajuste el pH del LB a 7.0 agregando hidróxido de sodio (NaOH) 5M. Esto solo debería requerir alrededor de 0.2 mL de NaOH.</li>
	<li>Autoclave el medio LB ajustado por pH en un ciclo de líquido durante 45 minutos a 15 psi. Deje que la solución se enfríe y guárdela a temperatura ambiente.</li>
	<li>Inocular una sola colonia de bacterias en 100 mL de LB en un matraz Erlenmeyer de 500 mL. Cultive las bacterias durante la noche en una incubadora agitadora a 37 °C.</li>
	<li>Dependiendo de la salud de la colonia bacteriana, el tamaño del matraz y la velocidad a la que esté ajustado el agitador, el tiempo que tardan las bacterias en crecer puede variar. Después de ~14 h, verifique la densidad óptica (OD) de las bacterias a 600 nm (OD600).</li>
	<li>Retire las bacterias del agitador cuando el diámetro exterior600 sea 3.0 (1 x 109 unidades formadoras de colonias (UFC)/ml). Si el diámetro exterior600 es inferior a 3,0, devuelva el matraz a la incubadora agitadora hasta alcanzar el diámetro exterior deseado.</li>
	<li>Alícuota de las bacterias en tubos cónicos de 50 ml y almacenarlas a 4 °C o continuar con el siguiente paso.</li>
</ol>2. Trabajar con paraformaldehído
NOTA: La concentración de paraformaldehído (PFA) utilizada y la duración de la exposición pueden variar un poco según el clima, la ubicación y el tipo de bacteria que se esté tratando. Un buen punto de partida para OP50 es la exposición a PFA al 0,5% durante 1 h, mientras que el PFA al 0,25% durante 1 h puede ser suficiente para HT115.
<ol><li>Prepare existencias de PFA al 32 % o use una solución de PFA al 32 % comprada comercialmente. Use el equipo de protección personal (EPP) adecuado cuando trabaje con PFA. Use guantes y protección para los ojos.</li>
	<li>Agregue PFA dentro de una campana de extracción de gases químicos con ventilación adecuada. Deseche los lavados y puntas que contengan PFA en recipientes adecuados para productos químicos peligrosos en la campana extractora.</li>
</ol>3. Tratamiento bacteriano con paraformaldehído
<ol><li>Una vez que las bacterias alcancen un OD600 de 3,0, utilice una pipeta serológica para transferir 50 ml a un nuevo matraz Erlenmeyer de 250 ml. Guarde el resto para un control en vivo, un control simulado (consulte el paso 4) o para tratar también con PFA según sea necesario.</li>
	<li>Evite verter de un matraz a otro y tenga cuidado de no salpicar los lados del nuevo matraz con bacterias. Las colonias en el costado del matraz pueden recibir una dosis más baja de PFA.</li>
	<li>En la campana química, agregue 781 μL de PFA al 32% a 50 ml de bacterias para llevar la concentración final al 0,5%. Deseche la punta utilizada en un contenedor de desechos sólidos para productos químicos peligrosos.</li>
	<li>Cubra el matraz con papel de aluminio y vuelva a colocarlo en la incubadora agitadora a 37 °C durante 1 h. Después de 1 h, retire el matraz de la incubadora y continúe con el paso 5.</li>
</ol>4. Control simulado
<ol><li>Una vez que las bacterias alcancen un OD600 de 3,0, utilice una pipeta serológica para transferir 50 ml de las bacterias a un tubo cónico de 50 ml.</li>
	<li>Continúe con el paso 5.3 para completar los pasos de lavado similares a los del grupo tratado con PFA.</li>
</ol>5. Lavar las bacterias para eliminar los residuos de PFA
<ol><li>En la campana química, utilice una pipeta serológica para transferir las bacterias tratadas del matraz Erlenmeyer a un tubo cónico de 50 ml. El uso de una pipeta serológica en lugar de verter las bacterias evitará la contaminación de cualquier colonia bacteriana en el borde del matraz que pueda haber evitado el tratamiento directo con PFA.</li>
	<li>Centrifugar las bacterias tratadas a aproximadamente 3000 x g durante 20 min. Retire el sobrenadante desechándolo en un contenedor de residuos líquidos peligrosos para productos químicos en la campana química.</li>
	<li>Agregue 25 ml de LB y vórtice para resuspender el gránulo bacteriano (llenar el tubo por completo dificulta la resuspensión del gránulo). Repetir la centrifugación y la resuspensión de pellets 4 veces.</li>
	<li>Vuelva a suspender el gránulo en volúmenes óptimos para diferentes ensayos. Para los ensayos de vida útil, siembre placas de 60 mm con 200 μL de bacterias resuspendidas en 10 mL de LB. La resuspensión de las bacterias en 10 mL de LB da como resultado una concentración de 5 veces mayor que el cultivo original de 50 mL.</li>
	<li>Almacenar las bacterias a 4 °C.</li>
</ol>6. Control de calidad del crecimiento bacteriano
<ol><li>Después del lavado final y la resuspensión, raye una placa LB (con una punta de pipeta estéril) con las bacterias preparadas. Es una buena práctica rayar el LB utilizado para lavar y volver a suspender en una placa separada para asegurarse de que el LB utilizado no esté contaminado.</li>
	<li>Coloque las placas en una incubadora a 37 °C durante la noche. Compruebe si hay algún crecimiento. Las bacterias se consideran muertas replicativamente cuando las colonias no crecen en la placa LB.</li>
</ol>7. Control de calidad del metabolismo bacteriano mediante un respirómetro
<ol><li>Después del lavado final y la resuspensión del paso 5.4, confirme que las bacterias están metabólicamente muertas utilizando las herramientas disponibles, como los respirómetros19,20 y midiendo la tasa de consumo basal de oxígeno (OCR).</li>
	<li>Preparar la solución M9: Disolver 3 g de fosfato de potasio monobásico (KH 2 PO 4),6 g de fosfato de sodio dibásico (Na2HPO4) y 5 g de cloruro de sodio (NaCl) en 950 ml de agua destilada. Autoclave en un ciclo de líquido durante 45 minutos a 15 psi, luego deje que la solución se enfríe a temperatura ambiente. Agregue 1 mL de sulfato de magnesio 1 M (MgSO4) y guárdelo a temperatura ambiente.</li>
	<li>Hidratar el cartucho del respirómetro: Agregue 200 μL de calibrante a todos los pocillos de una placa de 96 pocillos. Coloque el cartucho en la placa de 96 pocillos e incube durante la noche en una incubadora a 37 °C.</li>
	<li>Calibración del ensayo: Al día siguiente, coloque el cartucho hidratado en la máquina y comience la calibración.</li>
	<li>Configuración de la placa de prueba de ensayo: Con una nueva placa de 96 pocillos, agregue 160 μL de M9 y 40 μL de las bacterias preparadas (1 x 109 UFC/mL) para probar los pocillos. Agregue 200 μL de M9 a los 4 pocillos de esquina para usarlos como pocillos en blanco. Añadir 160 μL de M9 y 40 μL de LB utilizados para lavar y resuspender para usar como controles negativos. Añadir 200 μL de M9 al resto de pocillos que no se vayan a utilizar.</li>
	<li>Ejecute el ensayo: Una vez completada la calibración del cartucho, inserte la placa de ensayo del paso 7.5 en la máquina para su análisis. Los ajustes incluyen pasos para mezclar, esperar, medir y hacer un bucle. Los resultados se mostrarán como tasa de consumo de oxígeno (OCR). Las bacterias están metabólicamente muertas y listas para usar cuando el OCR es cero.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65775/65775fig01.jpg"> Figura 1. Flujo de trabajo para el tratamiento con paraformaldehído. Una sola colonia de la bacteria E. coli OP50 se cultiva durante la noche. Se añade PFA a una concentración final del 0,5% y el cultivo tratado con PFA se agita durante 1 h a 37 °C. Finalmente, el PFA se elimina lavando el cultivo con LB fresco 5x. Para confirmar que las bacterias tratadas están inactivas de forma replicativa, saque una placa LB de las bacterias tratadas y crezca durante la noche. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65775/65775fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Inactivación metabólica bacteriana en Caenorhabditis elegans mediante paraformaldehído

<ol>
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Los autores no tienen nada que revelar.

Beneficios de la eliminación de PFA en relación con otros métodos de eliminación de bacterias El tratamiento con PFA es un método de alto rendimiento para prevenir el metabolismo bacteriano mientras se mantiene una fuente de alimento nutritivo para C. elegans. La eliminación de bacterias mediante el tratamiento con PFA tiene múltiples ventajas sobre otros métodos. A diferencia del tratamiento UV, en el que cada placa debe probarse para comprobar si se ha eliminado con éxito, se puede...

Caenorhabditis elegans fue propuesto originalmente como un organismo modelo en 19651 y desde entonces ha sido ampliamente adoptado en estudios de genética, desarrollo, comportamiento, envejecimiento y metabolismo2. Debido a su gran tamaño de cría y a su cutícula transparente, C. elegans es especialmente adecuado para el cribado de alto rendimiento con reporteros fluorescentes3. Su corto ciclo de vida, su reproducción hermafrodita y su homología genética con los humanos también hacen de C. elegans un valioso sistema modelo para estudios sobre el desarrollo4 y la biología del envejecimiento5. Además, C. elegans es relativamente fácil de mantener. Los gusanos pueden cultivarse en cultivo líquido o en placas de agar sólido y consumir una dieta de bacterias vivas Escherichia coli OP504.
Sin embargo, la fuente de alimento vivo de C. elegans puede confundir los estudios sobre el metabolismo, la suplementación con medicamentos y el comportamiento. Debido a que las bacterias vivas tienen su propio metabolismo, las condiciones experimentales que afectan a las bacterias también alteran los nutrientes y metabolitos disponibles para los gusanos. Por ejemplo, las diferencias en las concentraciones bacterianas de hierro, aminoácidos y folato tienen diversos efectos en el desarrollo, la fisiología y la esperanza de vida de C. elegans. Muchas prácticas comunes de laboratorio pueden provocar tales cambios en la composición de nutrientes y metabolitos producidos por OP50. Específicamente, la exposición a la 5-fluoro-2'-desoxiuridina (FUdR), un compuesto comúnmente utilizado para prevenir la reproducción en C. elegans, provoca amplios cambios en la expresión génica de OP50, incluidas las vías de biosíntesis de aminoácidos7. Las bacterias vivas también pueden confundir los estudios en los que C. elegans se complementa con moléculas pequeñas porque las bacterias pueden metabolizar parcial o completamente los compuestos activos. Además, los efectos de estas pequeñas moléculas sobre las bacterias pueden, a su vez, alterar la fisiología de C. elegans, como se informó con el fármaco metformina8, que prolonga la vida útil. Finalmente, las bacterias vivas pueden cambiar el entorno del gusano de maneras que alteran el comportamiento, como la secreción de olores atractivos9, la producción de neuromoduladores exógenos10 y la creación de gradientes de oxígeno en un césped de bacterias densas11.
Para mitigar los efectos de confusión del metabolismo bacteriano en la investigación de C. elegans , se han desarrollado múltiples métodos para matar bacterias (Tabla 1). Tres estrategias comunes para eliminar la OP50 son la irradiación UV, la eliminación del calor y el tratamiento con antibióticos. Si bien son sencillos y de costo relativamente bajo, cada uno de estos métodos puede tener efectos indeseables tanto en las bacterias como en C. elegans. La eliminación de UV a través de un reticulante UV12 es de bajo rendimiento y la velocidad está limitada por el número de placas que pueden caber en el reticulante UV. Además, la eficacia de la eliminación de los rayos UV puede variar de una placa a otra dentro de un lote, y las pruebas de crecimiento en todas las placas pueden resultar difíciles en experimentos grandes. Matar el calor de OP50 al exponer el cultivo a temperaturas de >60 °C conlleva un conjunto separado de desafíos. Las altas temperaturas pueden dañar los nutrientes esenciales para la lombriz y destruir la estructura celular de las bacterias, creando una textura más suave que disminuye la cantidad de tiempo que las lombrices pasan enla comida. Este método tampoco se puede utilizar durante todo el ciclo de vida de C. elegans porque los gusanos alimentados con bacterias muertas por calor pueden detenerse en las primeras etapas del desarrollo13. El tratamiento con antibióticos es un tercer método común para suprimir el metabolismo bacteriano14, pero los antibióticos también pueden alterar el crecimiento y el metabolismo de las lombrices15.
Una solución para eliminar los efectos metabólicos de las bacterias vivas mientras se preserva la estructura bacteriana y los nutrientes esenciales es matar el OP50 con paraformaldehído (PFA)16. El PFA es un polímero de formaldehído que puede reticularmente proteínas dentro de las células17 para evitar la replicación bacteriana sin destruir las estructuras celulares internas como la membrana plasmática interna18. Debido a esta preservación de la estructura celular interna, las bacterias tratadas con PFA no exhiben crecimiento ni actividad metabólica, pero siguen siendo una fuente de alimento comestible y rica en nutrientes para C. elegans16. Aquí, se proporciona un protocolo detallado que muestra cómo inactivar metabólicamente las bacterias usando paraformaldehído.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Método</td>
			<td>Materiales requeridos</td>
			<td colspan="2">¿Escalable?</td>
			<td>¿Nutricional?</td>
			<td colspan="4">¿Efectos en Worm?</td>
		</tr><tr><td rowspan="4">UV</td>
			<td rowspan="4">Reticulante UV</td>
			<td colspan="2">Limitado por:</td>
			<td rowspan="4">Sí</td>
			<td colspan="4">Efectos variables sobre la esperanza de vida en NGM12, 23, 24</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Número de placas que caben en el reticulante UV</td>
			<td colspan="4">Efectos variables sobre la vida útil en FUdR24, 26, 27</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Tiempo de irradiación por placa</td>
			<td colspan="4" rowspan="2">Disminución de la preferencia alimentaria16</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Capacidad para revisar el crecimiento de cada placa8</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">Calor</td>
			<td rowspan="3">Incubadora a >60 °C</td>
			<td colspan="2" rowspan="3">Sí</td>
			<td rowspan="3">No: destruye la pared celular, disminuye el valor nutricional</td>
			<td colspan="4">Detención del desarrollo 13</td>
		</tr><tr><td colspan="4">Disminución de la preferencia alimentaria13</td>
		</tr><tr><td colspan="4">Prolonga la vida útil de NGM31</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">Antibióticos</td>
			<td rowspan="3">Antibióticos (kanamicina, carbenicilina, etc.)</td>
			<td colspan="2" rowspan="3">Sí</td>
			<td rowspan="3">Sí</td>
			<td colspan="4">Retrasa el crecimiento y el desarrollo15</td>
		</tr><tr><td colspan="4">Prolonga la vida útil en medios líquidos19</td>
		</tr><tr><td colspan="4">Prolonga la vida útil de NGM15</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">PFA</td>
			<td rowspan="3">0,5% Paraformaldehído</td>
			<td colspan="2" rowspan="3">Sí</td>
			<td rowspan="3">Sí</td>
			<td colspan="4">Disminución del tamaño de las crías pequeñas16</td>
		</tr><tr><td colspan="4">Pequeño aumento del tiempo de desarrollo16</td>
		</tr><tr><td colspan="4">Disminución de la preferencia alimentaria16</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 1. Comparaciones de métodos para matar OP50. La eliminación de los rayos UV, la eliminación del calor, el tratamiento con antibióticos y el tratamiento con PFA tienen efectos variados sobre el estado nutricional de las bacterias y la salud de las lombrices alimentadas con bacterias tratadas. Estos métodos para inactivar replicativamente E. coli también difieren en sus materiales requeridos y escalabilidad.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aluminum Foil</td>
			<td>Staples</td>
			<td>2549291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen burner</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470121-700&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Density Meter</td>
			<td>Denville</td>
			<td>80-3000-45&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorg</td>
			<td>5430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemical fume hood</td>
			<td>Labcono</td>
			<td>975050411384RG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conincal tubes (50 mL)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>339652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvettes&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-955-127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli OP50</td>
			<td>CGC</td>
			<td>OP50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmyer flasks</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>250 mL: FB501250 
			500 mL: FB501500 
			1000 mL: FB5011000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculation loop</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-363-605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1425500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid waste collection bottle</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1230G50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate (MgSO4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (32%)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714-S</td>
			<td>Paraformaldehyde &#8211; methanol free solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Eppendorf Easypet 3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic dishes (100 mm)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P2853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF Calibrant</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>100840-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 Extracellular Flux Assay Kit and Cell Culture Microplate</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>101085-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes (50 mL)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>12-107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker incubator</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>11 676 083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S640-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S318500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (Na2HPO4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S374-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solid waste collection bucket</td>
			<td>M&#38;M Industries</td>
			<td>&#160;5.0 Gallon M1 Traditional Pail</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>20-251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>11676331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing balance</td>
			<td>C Goldenwall</td>
			<td>HZ10K6B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>20-255</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methodology to metabolically inactivate bacteria for caenorhabditis elegans research

Caenorhabditis elegans es un organismo modelo común para la investigación en genética, desarrollo, envejecimiento, metabolismo y comportamiento. Debido a que C. elegans consume una dieta de bacterias vivas, la actividad metabólica de su fuente de alimento puede confundir los experimentos que buscan los efectos directos de diversas intervenciones en el gusano. Para evitar los efectos de confusión del metabolismo bacteriano, los investigadores de C. elegans han utilizado múltiples métodos para inactivar metabólicamente las bacterias, incluida la irradiación ultravioleta (UV), la eliminación del calor y los antibióticos. El tratamiento UV tiene un rendimiento relativamente bajo y no se puede utilizar en cultivos líquidos porque cada placa debe examinarse para detectar una eliminación bacteriana exitosa. Un segundo método de tratamiento, la eliminación por calor, afecta negativamente la textura y la calidad nutricional de las bacterias, lo que lleva a la detención del desarrollo de C. elegans. Por último, el tratamiento con antibióticos puede alterar directamente la fisiología de C. elegans , además de prevenir el crecimiento bacteriano. Este manuscrito describe un método alternativo para inactivar metabólicamente bacterias utilizando paraformaldehído (PFA). El tratamiento con PFA retila las proteínas dentro de las células bacterianas para prevenir la actividad metabólica al tiempo que preserva la estructura celular y el contenido nutricional. Este método es de alto rendimiento y se puede utilizar en cultivos líquidos o placas sólidas, ya que la prueba de crecimiento de una placa de bacterias tratadas con PFA valida todo el lote. La inactivación metabólica a través del tratamiento con PFA se puede utilizar para eliminar los efectos de confusión del metabolismo bacteriano en los estudios de suplementación con fármacos o metabolitos, resistencia al estrés, metabolómica y comportamiento en C. elegans.

Caenorhabditis elegans was originally proposed as a model organism in 19651 and has since been widely adopted in studies of genetics, development, behavior, aging, and metabolism2. Due to their large brood size and transparent cuticle, C. elegans is particularly well-suited for high-throughput screening with fluorescent reporters3. Their short life cycle, hermaphroditic reproduction, and genetic homology with humans also make C. elegans a valuable model system for studies on development4 and aging biology5. Moreover, C. elegans are relatively easy to maintain. Worms can be grown in liquid culture or on solid agar plates and consume a diet of live Escherichia coli OP50 bacteria4.
However, the live food source of C. elegans can confound studies of metabolism, drug supplementation, and behavior. Because live bacteria have their own metabolism, experimental conditions that affect the bacteria also alter the nutrients and metabolites available to the worms. For example, differences in bacterial iron, amino acid, and folate concentrations have diverse effects on C. elegans&#39; development, physiology, and lifespan6. Many common lab practices can elicit such changes in the nutrient composition and metabolites produced by OP50. Specifically, exposure to 5-fluoro-2&#39;-deoxyuridine (FUdR), a compound commonly used to prevent reproduction in C. elegans, elicits broad changes in OP50 gene expression, including amino acid biosynthesis pathways7. Live bacteria can also confound studies in which C. elegans are supplemented with small molecules because bacteria can partially or completely metabolize the active compounds. Moreover, the effects of these small molecules on the bacteria can, in turn, alter C. elegans physiology, as was reported with the lifespan-extending drug metformin8. Finally, live bacteria can change the worm&#39;s environment in ways that alter behavior, such as secreting attractive odorants9, producing exogenous neuromodulators10, and creating oxygen gradients in a dense bacteria lawn11.
To mitigate the confounding effects of bacterial metabolism on C. elegans research, multiple methods for killing bacteria have been developed (Table 1). Three common strategies for killing OP50 are UV-irradiation, heat-killing, and antibiotic treatment. While straightforward and relatively low-cost, each of these methods can have undesirable effects on both bacteria and C. elegans. UV-killing via a UV crosslinker12 is low-throughput and the rate is limited by the number of plates that can fit in the UV crosslinker. Moreover, the efficacy of UV-killing can vary from plate to plate within a batch, and testing for growth on all plates can become difficult in large experiments. Heat-killing OP50 by exposing culture to temperatures of &#62;60 &#176;C comes with a separate set of challenges. High heat can damage nutrients essential for the worm and destroy the cellular structure of bacteria, creating a softer texture that decreases the amount of time worms spend on the food13. This method also cannot be used throughout the life cycle of C. elegans because worms fed heat-killed bacteria can arrest early in development13. Antibiotic treatment is a third common method for suppressing bacterial metabolism14, but antibiotics can also alter worm growth and metabolism15.
One solution to eliminate the metabolic effects of live bacteria while preserving bacterial structure and essential nutrients is to kill OP50 with paraformaldehyde (PFA)16. PFA is a polymer of formaldehyde that can crosslink proteins within cells17 to prevent bacterial replication without destroying internal cell structures like the inner plasma membrane18. Due to this preservation of internal cellular structure, PFA-treated bacteria exhibit no growth or metabolic activity but remain an edible and nutrient-rich food source for C. elegans16. Here, a detailed protocol is provided which shows how to metabolically inactivate bacteria using paraformaldehyde.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Method</td>
			<td>Required Materials</td>
			<td colspan="2">Scalable?</td>
			<td>Nutritional?</td>
			<td colspan="4">Effects on Worm?</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">UV</td>
			<td rowspan="4">UV-crosslinker</td>
			<td colspan="2">Limited by:</td>
			<td rowspan="4">Yes</td>
			<td colspan="4">Variable effects on lifespan on NGM12, 23, 24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Number of plates that fit in UV-crosslinker</td>
			<td colspan="4">Variable effects on lifespan on FUdR24, 26, 27</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Irradiation time per plate</td>
			<td colspan="4" rowspan="2">Decreased food preference16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Ability to check every plate for growth8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Heat</td>
			<td rowspan="3">&#62;60 &#176;C incubator</td>
			<td colspan="2" rowspan="3">Yes</td>
			<td rowspan="3">No: destroys cell wall, decreased nutritional value</td>
			<td colspan="4">Developmental arrest 13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Decreased food preference13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Extends lifespan on NGM31</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Antibiotics</td>
			<td rowspan="3">Antibiotics (kanamycin, carbenicillin, etc.)</td>
			<td colspan="2" rowspan="3">Yes</td>
			<td rowspan="3">Yes</td>
			<td colspan="4">Delays growth and development15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Extends lifespan in liquid media19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Extends lifespan on NGM15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">PFA</td>
			<td rowspan="3">0.5% Paraformaldehyde</td>
			<td colspan="2" rowspan="3">Yes</td>
			<td rowspan="3">Yes</td>
			<td colspan="4">Small brood size decrease16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Small development time increase16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Decreased food preference16</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table 1. Comparisons of methods to kill OP50. UV-killing, heat-killing, antibiotic-treatment, and PFA-treatment have varied effects on the nutritional status of the bacteria and the health of worms fed treated bacteria. These methods for replicatively inactivating E. coli also differ in their required materials and scalability.

Autor destacado: Avance de la investigación de Caenorhabditis elegans utilizando bacterias tratadas con paraformaldehído 

Metodología para la inactivación metabólica de bacterias para la investigación de Caenorhabditis elegans

A challenge in sea elegance research is isolating the effects of a live bacterial diet from the effects of experimental manipulations. It can be difficult to determine whether the manipulation directly impacts the host or indirectly impacts the worms through a host microbiome interactions. Paraformaldehyde treated bacteria address the challenge of isolating the effects of bacterial metabolism from host physiology.Paraformaldehyde treatment is high throughput and consistently renders the bacteria replicate and metabolically inactive. In addition to its consistency PFA treated bacteria remain a palatable and nutritious food source.

En la Figura 1 se muestra un flujo de trabajo detallado del protocolo. Se desarrolló y optimizó un método de alto rendimiento para inactivar consistentemente la replicación bacteriana (Figura 2A) y el metabolismo (Figura 2B) para estudios metabólicos y de fármacos en la investigación de C. elegans utilizando paraformaldehído16. El objetivo era determinar la concentración más baja de PFA nec...

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La fuente de alimento para Caenorhabditis elegans en el laboratorio es Escherichia coli viva. Dado que las bacterias son metabólicamente activas, presentan una variable de confusión en los estudios metabólicos y farmacológicos en C. elegans. Aquí se describe un protocolo detallado para inactivar metabólicamente las bacterias utilizando paraformaldehído.

Caenorhabditis elegans is a common model organism for research in genetics, development, aging, metabolism, and behavior. Because C. elegans consume a ...

Un reto en la investigación de la elegancia marina es aislar los efectos de una dieta bacteriana viva de los efectos de las manipulaciones experimentales. Puede ser difícil determinar si la manipulación afecta directamente al huésped o indirectamente a los gusanos a través de las interacciones del microbioma del huésped. Las bacterias tratadas con paraformaldehído abordan el desafío de aislar los efectos del metabolismo bacteriano de la fisiología del huésped.El tratamiento con paraformaldehído es de alto rendimiento y hace que las bacterias se repliquen y queden metabólicamente inactivas. Además de su consistencia, las bacterias tratadas con PFA siguen siendo una fuente de alimento sabrosa y nutritiva.

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Research

JoVE Journal

Biology

Methodology to Metabolically Inactivate Bacteria for Caenorhabditis elegans Research

1.9K vistas.  University of Michigan, Ann Arbor. Un reto en la investigación de la elegancia marina es aislar los efectos de una dieta bacteriana viva de los efectos de las manipulaciones experimentales. Puede ser difícil determinar si la manipulación afecta directamente al huésped o indirectamente a los gusanos a través de las interacciones del microbioma del huésped. Las bacterias tratadas con paraformaldehído abordan el desafío de aislar los efectos del metabolismo bacteriano de la fisiología del huésped.El tratamiento c...

Video: Autor destacado: Avance de la investigación de Caenorhabditis elegans utilizando bacterias tratadas con paraformaldehído 

Caenorhabditis elegans is a common model organism for research in genetics, development, aging, metabolism, and behavior. Because C. elegans consume a diet of live bacteria, the metabolic activity of their food source can confound experiments looking for the direct effects of various interventions on the worm. To avoid the confounding effects of bacterial metabolism, C. elegans researchers have used multiple methods to metabolically inactivate bacteria, including ultraviolet (UV)-irradiation, heat-killing, and antibiotics. UV treatment is relatively low-throughput and cannot be used in liquid culture because each plate must be examined for successful bacterial killing. A second treatment method, heat-killing, negatively affects the texture and nutritional quality of the bacteria, leading to the developmental arrest of C. elegans. Finally, antibiotic treatment can directly alter C. elegans physiology in addition to preventing bacterial growth. This manuscript describes an alternative method to metabolically inactivate bacteria using paraformaldehyde (PFA). PFA treatment cross-links proteins within bacterial cells to prevent metabolic activity while preserving cellular structure and nutritional content. This method is high-throughput and can be used in liquid culture or solid plates, as testing one plate of PFA-treated bacteria for growth validates the whole batch. Metabolic inactivation through PFA treatment can be used to eliminate the confounding effects of bacterial metabolism on studies of drug or metabolite supplementation, stress resistance, metabolomics, and behavior in C. elegans.

The food source for Caenorhabditis elegans in the lab is live Escherichia coli. Since bacteria are metabolically active, they present a confounding variable in metabolic and drug studies in C. elegans. A detailed protocol to metabolically inactivate bacteria using paraformaldehyde is described here.

Investigación

Biología

Bacterial Inoculation and Paraformaldehyde Inactivation for Caenorhabditis elegans Research

Bacterial Inoculation and Paraformaldehyde Inactivation for  Caenorhabditis elegans  Research  

Begin by inoculating a single bacterial colony into 200 milliliters of sterilized Luria broth in a 500-milliliter Erlenmeyer flask. Culture the bacteria overnight in a shaker incubator set at 37 degrees. After 14 hours of culture, check the optical density of the bacteria at 600 nanometers.Aliquot the bacteria into 50-milliliter conical tubes and store them at four degrees Celsius for further use. Using a serological pipette, transfer 50 milliliters of the bacterial culture into a new 250-milliliter Erlenmeyer flask Labeled the tubes for live or mock-treated control. Use a serological pipette to transfer 50 milliliters of the bacteria to a 50-milliliter conical tube for the mock-treated control before washing.In the chemical hood, add 781 microliters of paraformaldehyde to the bacterial culture to achieve a final concentration of 0.5%Dispose of the used tip in a solid waste chemical hazard container. Next cover the flask with a sheet of foil and place it in a shaker incubator at 37 degrees Celsius for one hour. Once incubation is complete, wash the bacteria to remove any residual paraformaldehyde.For the removal of the residual paraformaldehyde, using a serological pipette, transfer the treated bacteria from the Erlenmeyer flask to a 50-milliliter conical tube. Next centrifuge the treated bacteria at approximately 3000 G for 20 minutes. Discard the supernatant into a liquid waste chemical hazard container inside the chemical hood.Now add 25 milliliters of the Luria broth to the treated and control bacterial pellets, and vortex to resuspend the bacterial pellets. Repeat the centrifugation and pellet resuspension four times. In preparation for various assays, resuspend the pellet in suitable volumes.For lifespan assays. Seed 200 microliters of bacteria resuspended in 10 milliliters of Luria broth onto 60-millimeter plates. Store the bacteria at four degrees Celsius.To perform a quality check of the bacterial growth, streak a Luria broth plate with a prepared bacteria using a sterile pipette tip. To verify contamination, steak the Luria broth used for washing and resuspending on a separate plate. Next place the plates in a 37 degrees Celsius incubator overnight.The next day, check for any bacterial growth. Save the bacteria if paraform aldehyde preparation is successful and colonies fail to grow on the LB plate. To check the bacterial metabolic activity with a respirometer, first hydrate the cartridge by adding 200 microliters of calibrant to all wells on a 96-well plate.Place the cartridge in the 96-well plate and incubate overnight at 37 degrees Celsius. Set the machine to mix, weight, measure, and loop. The next day, place the hydrated cartridge into the machine.To a new 96-well plate, add 160 microliters of M9 to the test wells, followed by 40 microliters of prepped bacteria. Add 200 microliters of M9 into the four corner wells to act as blanks. Dispense 160 microliters of M9 and 40 microliters of Luria broth as negative controls.Finally, pipette 200 microliters of M9 into the remaining unused wells. Then replace the ejected calibration plate with the assay plate before running the program. The results will be displayed as the oxygen consumption rate.Different strains exhibited different inactivation response times to paraformaldehyde. For example, exposure of HB101 bacteria to 0.25%for one hour is sufficient to render it metabolically inactive. Enterococcus faecalis required a 1.0%concentration for consistent effect.Caenorhabditis elegans worms exhibited similar preferences toward the treated OP 50 strains as well as the mock-treated control. However, a sensitive pairwise assay revealed a stronger preference for the mock-treated control. Worms on treated OP 50 have a higher pumping rate than worms on the mock-treated control.Consumption of treated bacteria resulted in delayed development time in wild-type worms, as well as lowered egg laying capacity. The lifespan of the worms was not significantly different from each other, regardless of the food source. However, the paraformaldehyde-treated bacteria increased the worm lifespan in the presence of 5-Fluoro-2'deoxyuridine Consumption of the paraformaldehyde-treated bacteria by a long-lived worm strain did not alter its longevity.