Questo lavoro è stato sostenuto dal Dipartimento provinciale di scienza e tecnologia del Sichuan (2021YJ0175).

Il protocollo e le procedure sperimentali hanno ricevuto l'approvazione del Comitato amministrativo e di ricerca sugli animali dell'Università di Medicina Tradizionale Cinese di Chengdu (Numero di registrazione: 2022DL-010). I ratti maschi di Sprague Dawley (SD) di otto settimane, del peso di 180-200 g, sono stati ottenuti commercialmente (vedi Tabella dei materiali) e alloggiati in un ciclo naturale luce/buio con temperatura controllata (23 ± 2 °C) e umidità relativa (55% ± 10%). Dodici ratti sono stati divisi in modo casuale in due gruppi: il gruppo di controllo e il gruppo AR. Tutti i ratti sono stati acclimatati a queste condizioni e hanno avuto libero accesso a cibo e acqua per una settimana prima della sperimentazione.
1. Creazione di un modello di ratto di AR
<ol><li>Preparazione della soluzione sensibilizzante: sospendere 30 mg di ovoalbumina (OVA) e 3 g di Al(OH)3 in 100 mL di soluzione fisiologica (vedi Tabella dei Materiali)14,15.</li>
	<li>Sensibilizzazione di base: afferrare e tenere il ratto completamente sveglio con l'addome rivolto verso l'alto. Disinfettare l'addome utilizzando batuffoli di cotone imbevuti di alcol al 75%. Utilizzare una siringa da 1,5 mL per iniettare 1 mL della soluzione sensibilizzante preparata nella fase 1.1 nella cavità addominale sinistra dei ratti del gruppo AR. Ripeta l'iniezione una volta ogni due giorni per 14 giorni (Figura 1A). NOTA: Assicurarsi che la testa del ratto sia posizionata più in basso rispetto alla coda per evitare danni all'intestino crasso e tenue durante l'inserimento della siringa. Il sito di iniezione si trova a 1,5 cm dalla linea mediana ventrale. I ratti del gruppo di controllo devono ricevere iniezioni intraperitoneali di 1 mL di soluzione fisiologica normale una volta ogni due giorni per 14 giorni.</li>
	<li>Provocazione nasale: somministrare 50 μL di OVA al 5% tramite gocce nasali utilizzando una pipetta da 100 μL (Figura 1B) il giorno successivo alla sensibilizzazione basale, ripetendo questa procedura per 7 giorni (Figura 1C). NOTA: Preparare la soluzione di OVA al 5% mescolando 5 g di OVA con 100 mL di soluzione fisiologica. Per il gruppo di controllo, somministrare gocce dello stesso volume di soluzione fisiologica.</li>
</ol>2. Punteggio comportamentale dei ratti
<ol><li>Entro 30 minuti dal completamento della sfida nasale finale, osservare e registrare i ratti utilizzando una fotocamera digitale per identificare sintomi come grattarsi il naso, starnutire e naso che cola, in base ai criteri di punteggio delineati nella Tabella 1 (Figura 1D). NOTA: La conferma del successo della modellazione AR si basa sul raggiungimento di un punteggio totale di ≥5 punti14.</li>
</ol>3. Acquisizione di campioni di mucosa nasale
<ol><li>Sacrificare i ratti: sacrificare i ratti esponendoli a un'overdose di CO2 . Successivamente, disinfettare i ratti con etanolo al 75% (vedi Tabella dei materiali). Utilizzare un bisturi per praticare un'incisione lungo i due angoli della bocca per esporre il tessuto muscolare (Figura 2A). Successivamente, tagliare le articolazioni dell'osso zigomatico e della mandibola su entrambi i lati del cranio utilizzando delle forbici per tessuti (Figura 2B) e rimuovere la mandibola (Figura 2C).</li>
	<li>Esposizione della cavità nasale: separare la pelle della mascella utilizzando un emostatico (Figura 2D) per esporre la cavità nasale (Figura 2E). Tagliare la connessione ossea tra la cavità nasale e la mascella con delle forbici per tessuti (Figura 2F). Quindi, recidere la connessione tra la cavità nasale e le ossa orbitali su entrambi i lati del forame infraorbitale (Figura 2G) e rimuovere la cavità nasale (Figura 2H).</li>
	<li>Fissazione: porre la cavità nasale estratta in paraformaldeide al 4% per il fissaggio e conservarla a temperatura ambiente per 24-72 h (vedi Tabella dei Materiali). NOTA: Assicurarsi che la quantità di fissativo paraformaldeide utilizzata sia sufficiente a coprire completamente le sezioni per un corretto fissaggio.</li>
</ol>4. Pre-trattamento di campioni di mucosa nasale
<ol><li>Decalcificazione: iniziare fissando i tessuti rimossi dal punto 3.1. Lavali tre volte con PBS per 20 minuti ciascuno. Seguili lavandoli tre volte con acqua distillata, ogni volta per 20 minuti. Successivamente, decalcificare i tessuti in una soluzione di decalcificazione con un volume di 20-30 volte quello dei tessuti a temperatura ambiente.<ol><li>La soluzione di decalcificazione (vedi Tabella dei Materiali) deve mantenere un pH di 7,2-7,4. Infine, metti il tessuto decalcificato in una scatola di disidratazione. NOTA: La soluzione decalcificante deve essere cambiata settimanalmente. Il processo di decalcificazione può concludersi quando il tessuto si ammorbidisce (circa 2 mesi).</li>
	</ol></li>
	<li>Disidratazione e ceretta: trasferire la scatola di disidratazione in un disidratatore (vedi Tabella dei materiali). Inizia con il 75% di alcol per 4 ore, seguito dall'85% di alcol per 2 ore, dal 90% di alcol per 2 ore e dal 95% di alcol per 1 ora.<ol><li>Successivamente, immergere il tessuto in etanolo anidro per 30 minuti, ripetere il processo per altri 30 minuti, utilizzare lo xilene per 5-10 minuti, ripetere questo passaggio per altri 5-10 minuti, immergere il tessuto nella cera per 1 ora, ripetere questo passaggio per un'altra ora e, infine, immergere il tessuto nella cera per un'altra 1 ora.</li>
	</ol></li>
	<li>Incasso: posizionare il blocco di cera fusa nella scatola da incasso (vedi Tabella dei materiali) e conservarlo in un congelatore a -20 °C. Una volta che la cera si è solidificata, rimuoverla e tagliare il blocco di cera.</li>
	<li>Affettatura: inserire il blocco di cera rifilato in un microtomo di paraffina (vedi Tabella dei materiali) e tagliarlo a fette dello spessore di 3 μm. Mettere le fette a bagnomaria a 40 °C su uno spargivetrino. Appiattire il fazzoletto, quindi sollevarlo con un vetrino e cuocerlo in forno a 60 °C.<ol><li>Dopo che l'acqua è evaporata e la cera è stata fissata correttamente, rimuovere i vetrini e conservarli a una temperatura di 25 °C.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Colorazione H&E del tessuto mucoso nasale
<ol><li>Deceratura e idratazione: mettere le fette in xilene per 20 min, ripetere il processo per altri 20 min, etanolo assoluto per 5 min, ripetere questo passaggio per altri 5 min, alcol al 75% per 5 min, e infine, lavare per 5 min.</li>
	<li>Colorazione con ematossilina: erogare 100 μL di soluzione colorante con ematossilina (vedere Tabella dei materiali) per 3-5 minuti utilizzando una pipetta da 100 μL, risciacquare per 5-10 s, aggiungere 100 μL di etanolo acido cloridrico allo 0,5% per 10-30 s, risciacquare per 5-10 s, aggiungere 100 μL di acqua ammoniacale allo 0,2% per 10-30 s e risciacquare per 30 s. NOTA: Dopo la colorazione con ematossilina, è necessaria la differenziazione con etanolo acido cloridrico allo 0,5% per rimuovere il colorante ematossilico in eccesso legato al nucleo e assorbito dal citoplasma. Quando viene eseguita la colorazione con eosina, i nuclei e il citoplasma saranno chiaramente colorati. Le fette appariranno rosse o rosa dopo la differenziazione con etanolo acido cloridrico allo 0,5%, quindi risciacquare immediatamente dopo la differenziazione per rimuovere l'acido dalle fette di tessuto per arrestare la differenziazione. Quindi, utilizzare lo 0,2% di acqua ammoniacale per migliorare la colorazione nucleare.</li>
	<li>Colorazione con eosina: utilizzare una pipetta da 100 μL per erogare 100 μL di soluzione colorante con eosina (vedere la tabella dei materiali) per 5 minuti e risciacquare per 30 s.</li>
	<li>Disidratazione e sigillatura: immergere le fette in etanolo assoluto per 5 minuti, ripetere il processo per altri 5 minuti, ripetere ancora una volta per 5 minuti, dimetile per 5 minuti e xilene per 5 minuti. Infine, sigillare con resina neutra (vedi Tabella dei Materiali).</li>
	<li>Posizionamento della sezione colorata sul microscopio: posizionare la sezione colorata sul microscopio, regolare la messa a fuoco del microscopio fino a quando l'immagine non è chiaramente visibile, impostare l'ingrandimento su 40x e acquisire l'immagine.</li>
</ol>6. Immunocolorazione multicolore del tessuto mucoso nasale
<ol><li>Deceratura e idratazione: seguire le stesse indicazioni del punto 5.1.</li>
	<li>Trattamento tampone citrato-fosfato: mettere il tampone citrato-fosfato (pH 6,0) (vedi Tabella dei materiali) in un contenitore adatto al microonde. Scaldare fino a ebollizione, rimuoverlo e quindi aggiungere i vetrini al contenitore. Microonde a fuoco medio per 8 minuti fino a ebollizione, spegnere il fuoco per 8 minuti, quindi passare a fuoco medio-basso per 7 minuti.<ol><li>Dopo il raffreddamento naturale, trasferire le fette in PBS (pH 7,4), agitarle e lavarle tre volte con uno shaker decolorante, ogni volta per 5 min. NOTA: Assicurarsi che il tampone non evapori durante questo processo ed evitare che le fette si secchino.</li>
	</ol></li>
	<li>Bloccare la perossidasi endogena: asciugare le fette, tracciare un cerchio attorno al tessuto con una penna immunoistochimica (per evitare che l'anticorpo defluisca) e applicare una soluzione di perossido di idrogeno al 3% (acqua ossigenata: acqua pura = 1:9).<ol><li>Incubare a temperatura ambiente al buio per 15 min. Dopo il raffreddamento naturale, porre le fette in PBS (pH 7,4) e agitarle su uno shaker decolorante per tre cicli di 5 min ciascuno.</li>
	</ol></li>
	<li>Bloccante: applicare il siero di capra al 5% all'interno del cerchio e incubare per 30 min.</li>
	<li>Aggiunta di anticorpi primari: rimuovere delicatamente la soluzione bloccante, aggiungere FOXP3 (diluizione: 1:200, vedere la tabella dei materiali) alla fetta e porla in una camera umida. Incubare a 4 °C per una notte. NOTA: Aggiungere una piccola quantità d'acqua nella camera umida per evitare l'evaporazione degli anticorpi.</li>
	<li>Aggiunta di anticorpi secondari: porre le fette in PBS (pH 7,4) e agitarle su uno shaker decolorante per tre cicli di 5 minuti ciascuno. Asciugare delicatamente le fette e applicare l'anticorpo secondario (Goat Anti-Rabbit IgG H&L, vedi Tabella dei materiali) all'interno del cerchio. Incubare a temperatura ambiente per 50 minuti al buio.</li>
	<li>Preparazione della soluzione di diluizione di tiramide: combinare 100 μL di H 2 O2al 3% con 100 mL di 1x TBST (vedi tabella dei materiali).</li>
	<li>Aggiunta di soluzione di lavoro TSA: Miscelare 1 mL di diluente di tiramide con 2 μL di CY3-tiramide per preparare la soluzione di lavoro TSA. Applicare 100 μL di soluzione di lavoro TSA su ciascuna fetta e incubare a temperatura ambiente al buio per 10 minuti. Quindi, lavare le fette con PBS tre volte, 5 minuti ogni volta. NOTA: Preparare e utilizzare immediatamente la soluzione di lavoro TSA e conservarla al buio a 4 °C; È valido per un massimo di 24 ore.</li>
	<li>Ripetere i passaggi 6.2-6.8: passare a una diluizione 1:200 di RORγt (colorante fluorescente FICC) e poi a una diluizione 1:200 di TICAM1 (colorante TYP620) (vedi Tabella dei materiali).</li>
	<li>Nuclei controcolorati DAPI: agitare delicatamente le fette per asciugarle, applicare la soluzione colorante DAPI e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti al buio.</li>
	<li>Autofluorescenza di tempra: porre le fette in PBS (pH 7,4) e agitarle su uno shaker decolorante per tre cicli di 5 min ciascuno. Applicare il quencher di autofluorescenza (vedere Tabella dei materiali) sulle fette, attendere 5 minuti, quindi lavare per 10 minuti.</li>
	<li>Bloccaggio: porre le fette in PBS (pH 7,4) e agitarle su uno shaker decolorante per tre cicli di 5 min ciascuno. Agitare delicatamente le fette per asciugarle e sigillarle con il quencher antifluorescenza (vedi Tabella dei materiali).</li>
	<li>Microscopia: posizionare la sezione colorata sul microscopio, regolare la messa a fuoco del microscopio per una chiara visibilità, impostare l'ingrandimento su 20x e 40x e acquisire l'immagine. NOTA: DAPI ha una lunghezza d'onda di eccitazione UV di 330-380 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 420 nm (luce blu). FITC ha una lunghezza d'onda di eccitazione di 465-495 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 515-555 nm (luce verde). CY3 ha una lunghezza d'onda di eccitazione di 510-560 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 590 nm (luce rossa). TYP-690 ha una lunghezza d'onda di eccitazione di 630 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 690 nm (luce rosa).</li>
</ol>

Immunofluorescenza multicolore del tessuto nasale in un modello di ratto con rinite allergica

<ol>
	<li>Bro&#380;ek, J. 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Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foxp3+programs+the+development+and+function+of+CD4+CD25++regulatory+T+cells.">Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells.</a> Nature Immunology. 4 (4), 330-336 (2003).</li><li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Instability+of+the+transcription+factor+Foxp3+leads+to+the+generation+of+pathogenic+memory+T+cells+in+Vivo.">Instability of the transcription factor Foxp3 leads to the generation of pathogenic memory T cells in Vivo.</a> Nature Immunology. 10 (9), 1000-1007 (2009).</li><li>Ziegler, S. F., Buckner, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foxp3+and+the+regulation+of+Treg/Th17+differentiation.">Foxp3 and the regulation of Treg/Th17 differentiation.</a> Microbes and Infection. 11 (5), 594-598 (2009).</li><li>Yaling, Y., Gui, Y., Shuqi, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+research+advances+of+toll-like+receptors+and+allergic+rhinitis.">Recent research advances of toll-like receptors and allergic rhinitis.</a> Medical Recapitulate. 23 (7), 1273-1276 (2017).</li><li>Shan, H., Jie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+TLR4+gene+polymorphisms+and+allergic+rhinitis.">Correlation between TLR4 gene polymorphisms and allergic rhinitis.</a> Journal of Clinical Otorhinolaryngology, Head, and Neck Surgery. 31 (13), 991-994 (2017).</li><li>Xu, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoregulatory+mechanism+of+Treg+cells+and+TICAM-1+patients+with+severe+allergic+rhinitis.">Immunoregulatory mechanism of Treg cells and TICAM-1 patients with severe allergic rhinitis.</a> Chinese Journal of Coal Industry Medicine. 23 (3), 303-306 (2020).</li><li>Granier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tim-3+expression+on+tumor-infiltrating+PD-1+CD8++T+cells+correlates+with+poor+clinical+outcome+in+renal+cell+carcinoma.">Tim-3 expression on tumor-infiltrating PD-1+CD8+ T cells correlates with poor clinical outcome in renal cell carcinoma.</a> Cancer Research. 77 (5), 1075-1082 (2017).</li><li>Badoual, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1+expressing+tumor-infiltrating+T+cells+are+a+favorable+prognostic+biomarker+in+hpv-associated+head+and+neck+cancer.">PD-1 expressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in hpv-associated head and neck cancer.</a> Cancer Research. 73 (1), 128-138 (2013).</li><li>Gustavson, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+unsupervised+pixel-based+clustering+algorithm+for+compartmentalization+of+immunohistochemical+expression+using+automated+quantitative+analysis.">Development of an unsupervised pixel-based clustering algorithm for compartmentalization of immunohistochemical expression using automated quantitative analysis.</a> Applied Immunohistochemistry &amp; Molecular Morphology. 17 (4), 329-337 (2009).</li><li>Lu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+biomarker+modalities+for+predicting+response+to+PD-1/PD-L1+checkpoint+blockade:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Comparison of biomarker modalities for predicting response to PD-1/PD-L1 checkpoint blockade: a systematic review and meta-analysis.</a> JAMA Oncology. 5 (8), 1195-1204 (2019).</li><li>Hernandez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+immunofluorescence+tyramide+signal+amplification+for+immune+cell+profiling+of+paraffin-embedded+tumor+tissues.">Multiplex immunofluorescence tyramide signal amplification for immune cell profiling of paraffin-embedded tumor tissues.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 667067 (2021).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La rinite allergica (AR) è una malattia infiammatoria non infettiva della mucosa nasale derivante da una combinazione di fattori ambientali e genetici. È diventato un problema di salute globale, che ha un impatto sull'efficienza lavorativa, diminuisce la qualità della vita, compromette il sonno, la funzione cognitiva e causa irritabilità e affaticamento. L'AR colpisce il 10%-20% della popolazione mondiale¹ e comporta costi economici considerevoli, causando perdite annuali fino a 30-50 miliardi di euro nei paesi dell...

La rinite allergica (AR) è una malattia infiammatoria cronica non infettiva della mucosa nasale, mediata principalmente da immunoglobuline E (IgE) specifiche1,2. È caratterizzata da sintomi come starnuti, naso che cola, congestione nasale e prurito nasale. Con l'industrializzazione e l'urbanizzazione, la prevalenza dell'AR sta gradualmente aumentando, colpendo circa il 10%-20% della popolazione mondiale1. La tecnica dell'immunofluorescenza (IF) è un metodo di colorazione fluorescente che utilizza una reazione di legame anticorpo-antigene. Può essere impiegato per rilevare e quantificare la distribuzione e i livelli di espressione di proteine specifiche nei tessuti biologici o nelle cellule. Nella ricerca AR, l'IF può rilevare simultaneamente più bersagli, tra cui citochine correlate all'AR, cellule infiammatorie, recettori e altro ancora, facilitando l'esplorazione della patogenesi dell'AR e degli effetti dei farmaci 3,4,5,6.
Il processo di colorazione a immunofluorescenza multicolore (mIF) assomiglia molto all'IF, con l'aggiunta di una fase di eluizione dell'anticorpo durante ogni ciclo di colorazione. Questa modifica consente il rilevamento simultaneo di più biomarcatori sulla stessa sezione di tessuto attraverso una singola marcatura sequenziale e più cicli di ricolorazione. mIF si basa sull'amplificazione del segnale della tiramide (TSA), che consente cicli ripetuti di colorazione fluorescente TSA e l'uso del riscaldamento a microonde per rimuovere gli anticorpi mantenendo i segnali fluorescenti 7,8. Rispetto all'IF convenzionale, l'mIF offre diversi vantaggi: (1) è in grado di rilevare antigeni debolmente espressi che sono difficili da identificare con l'IFconvenzionale 9,10; (2) fornisce una colorazione di alta qualità con un migliore rapporto segnale/rumore; (3) consente di quantificare le strutture e le regioni di interesse tessuto-specifiche11; (4) il multiplexing di percorsi multipli utilizza in modo efficiente i tessuti e conserva risorse patologiche limitate12; (5) l'analisi multiparametrica attraverso mIF offre informazioni più approfondite sui tessuti, scoprendo informazioni biologiche nascoste13.
Nel complesso, mIF consente l'osservazione di diverse espressioni e distribuzioni dell'antigene all'interno dello stesso campione, facilitando lo studio delle proteine bersaglio. In futuro, i ricercatori che cercano di comprendere l'espressione e la distribuzione di più proteine bersaglio troveranno questa tecnica una scelta preziosa. Questo studio dimostra l'applicazione di mIF per la colorazione di campioni di mucosa nasale di ratti con AR e valuta la creazione di un modello di AR nel ratto.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Al(OH)3</td>
			<td>Sollerbauer Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>A7130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75% ethanol</td>
			<td>Anhui Yiren An Co., Ltd</td>
			<td>20210107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonia</td>
			<td>Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd</td>
			<td>2021070101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous ethanol</td>
			<td>Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd</td>
			<td>2022070501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-fluorescence quenching sealer</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic dyeing machine</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>Varistain Gemini ES</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carrier slides</td>
			<td>Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co., Ltd</td>
			<td>220518001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate-phosphate buffer&#160;</td>
			<td>Servicebio biotechnology co., Ltd</td>
			<td>G1201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid antigen repair solution (PH 6.0)</td>
			<td>Xavier Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>G1201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co.</td>
			<td>220518001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Nantong Mewtech Life Science Co., Ltd</td>
			<td>CS01-2450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CY3-Tyramide</td>
			<td>Sawell Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>G1223-50UL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sawell Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>G1012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decoloring shaker</td>
			<td>SCILOGEX</td>
			<td>S1010E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA decalcification solution</td>
			<td>Wuhan Xavier Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>CR2203047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric heating blast dryer&#160;</td>
			<td>Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd</td>
			<td>DHG-9240A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding box marking machine</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>&#160;PrintMate AS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding machine</td>
			<td>Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd</td>
			<td>JB-P5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast tissue dewatering machine</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>STP420 ES</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Film sealer</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>Autostainer 360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-Tyramide</td>
			<td>Sawell Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>G1222-50UL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Sunny Optical Technology Co.Ltd</td>
			<td>CX40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foxp3</td>
			<td>Affinity Biosciences Co., Ltd</td>
			<td>bs-10211R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing table</td>
			<td>Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd</td>
			<td>JB-L5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG H&#38;L (HRP)</td>
			<td>Liankebio Co., Ltd</td>
			<td>GAR0072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BL210A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H&#38;E staining kit</td>
			<td>Leagene</td>
			<td>DH0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostatic forceps</td>
			<td>Shanghai Medical Devices Co., Ltd</td>
			<td>J31010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sichuan Xilong Science Co., Ltd</td>
			<td>210608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunohistochemical pen</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BC004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave oven</td>
			<td>Midea</td>
			<td>M1-L213B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral gum</td>
			<td>Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10004160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovalbumin&#160;</td>
			<td>Sollerbauer Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>A804010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd</td>
			<td>DHG-9240A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palm centrifuge</td>
			<td>SCILOGEX</td>
			<td>D1008E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Beyotime Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>P0099-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pathology section scanner</td>
			<td>3DHISTECH Kft</td>
			<td>Pannoramic SCAN&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS buffer</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>G4202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette&#160;</td>
			<td>Dragon</td>
			<td>KE0003087/KA0056573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ror&#947;t</td>
			<td>Affinity Biosciences Co., Ltd</td>
			<td>DF3196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Quanzhou Excellence Medical Co., Ltd</td>
			<td>20170022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Self-fluorescent quenching agent Sudan Black B</td>
			<td>Bioengineering Co., Ltd</td>
			<td>A602008-0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slicer</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>HM325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slicing machine</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>HM325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide</td>
			<td>Nantong Mewtech Life Science Co., Ltd</td>
			<td>PC2-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sprague Dawley rats</td>
			<td>Sichuan Academy of Traditional Chinese Medicine</td>
			<td>SYX <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/65937/65937eq01.jpg" style="margin: auto;" /> 2023-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TICAM-1</td>
			<td>Affinity Biosciences Co., Ltd</td>
			<td>DF6289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue scissors</td>
			<td>Shanghai Medical Devices Co., Ltd</td>
			<td>J22120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue spreading baking sheet machine</td>
			<td>Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd</td>
			<td>JK-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TYR-690 fluorescent dyes</td>
			<td>Shanghai Rutron Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>RC0086-34RM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>SCILOGEX</td>
			<td>SLK-O3000-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath-slide drier</td>
			<td>Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd</td>
			<td>JK-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wax trimmer</td>
			<td>Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd</td>
			<td>JXL-818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd</td>
			<td>2022051901</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunofluorescent labeling in nasal mucosa tissue sections of allergic rhinitis rats via multicolor immunoassay

La rinite allergica (AR) è una malattia infiammatoria cronica e non infettiva della mucosa nasale, mediata principalmente da immunoglobuline E specifiche (IgE), che colpisce circa il 10%-20% della popolazione mondiale. Mentre la colorazione a immunofluorescenza (IF) è stata a lungo una tecnica standard per rilevare l'espressione proteica specifica della malattia, le tecniche convenzionali di IF sono limitate nella loro capacità di rilevare i livelli di espressione di tre o più proteine nello stesso campione. Di conseguenza, negli ultimi anni sono state sviluppate tecniche di IF multicolore, che consentono la marcatura simultanea di più bersagli in cellule o tessuti.
Questo protocollo fornisce una panoramica completa del processo per stabilire un modello di ratto di AR, ottenere campioni di mucosa nasale e le procedure tecniche per l'immunofluorescenza multicolore. Tutti i ratti del gruppo AR hanno mostrato sintomi tipici come starnuti, naso che cola e prurito al naso, con osservazioni comportamentali che hanno ottenuto un punteggio di ≥5 punti. La colorazione con ematossilina ed eosina (H&E) ha rivelato un aumento della conta delle cellule infiammatorie e un'integrità della mucosa nasale interrotta nel gruppo AR. L'immunofluorescenza multicolore (mIF) ha dimostrato un aumento dell'espressione di RORγt e TICAM-1, mentre l'espressione di Foxp3 è diminuita nel tessuto della mucosa nasale dei ratti AR.

Allergic rhinitis (AR) is a chronic, non-infectious inflammatory disease of the nasal mucosa primarily mediated by specific immunoglobulin E (IgE)1,2. It is characterized by symptoms such as sneezing, a runny nose, nasal congestion, and nasal itching. With industrialization and urbanization, the prevalence of AR is gradually increasing, affecting approximately 10%-20% of the world&#39;s population1. The immunofluorescence (IF) technique is a fluorescent staining method that utilizes an antibody-antigen binding reaction. It can be employed to detect and quantify the distribution and expression levels of specific proteins in biological tissues or cells. In AR research, IF can simultaneously detect multiple targets, including AR-related cytokines, inflammatory cells, receptors, and more, facilitating the exploration of AR pathogenesis and the effects of drugs3,4,5,6.
The multicolor immunofluorescence (mIF) staining process closely resembles traditional IF, with the addition of an antibody elution step during each round of staining. This modification enables the simultaneous detection of multiple biomarkers on the same tissue section through sequential single-labeling and multiple rounds of re-staining. mIF is based on tyramide signal amplification (TSA), allowing for repeated cycles of TSA fluorescent staining and the use of microwave heating to remove antibodies while retaining fluorescent signals7,8. In comparison to conventional IF, mIF offers several advantages: (1) it can detect weakly expressed antigens that are challenging to identify with conventional IF9,10; (2) it provides high-quality staining with an improved signal-to-noise ratio; (3) it allows for the quantification of tissue-specific structures and regions of interest11; (4) multiplexing multiple pathways efficiently utilizes tissues and conserves limited pathological resources12; (5) multi-parameter analysis through mIF offers deeper insights into tissues, uncovering hidden biological information13.
Overall, mIF allows the observation of different antigen expressions and distributions within the same sample, facilitating the study of target proteins. In the future, researchers seeking to understand the expression and distribution of multiple target proteins will find this technique a valuable choice. This study demonstrates the application of mIF for staining nasal mucosa samples from rats with AR and evaluate the establishment of a rat model of AR.

Autore in primo piano: Avanzamento della ricerca sulla rinite allergica con l'immunofluorescenza multicolore

Marcatura immunofluorescente in sezioni di tessuto della mucosa nasale di ratti con rinite allergica tramite test immunologico multicolore

Our main research is based on a study of allergic rhinitis. Our research intends to analyze what proteins are associated with allergic rhinitis. Multicolor immunofluorescence is currently used to advance research in our field.In future studies, we will focus on the possible mechanisms of TCM in the treatment of allergic rhinitis.

Sei ratti SD sono stati indotti con successo nel modello AR attraverso l'iniezione intraperitoneale OVA e la sfida nasale. L'AR è stata indotta in tutti i ratti del gruppo AR, che rappresentavano il 100% del gruppo. Tutti i ratti del gruppo AR hanno mostrato sintomi tipici come starnuti, naso che cola e prurito al naso. Tutte le osservazioni comportamentali hanno ottenuto un punteggio di ≥5 punti (Tabella 2).
I risultati della colorazione H&E al 21° giorno di mo...

Watch this Scientific Journal Video about Advancing Allergic Rhinitis Research with Multicolor Immunofluorescence at JoVE.com

Questo protocollo descrive una tecnica di immunofluorescenza multicolore per la valutazione del modello di rinite allergica nel ratto.

Allergic rhinitis (AR) is a chronic, non-infectious inflammatory disease of the nasal mucosa, primarily mediated by specific immunoglobulin E (IgE), ...

La nostra ricerca principale si basa su uno studio sulla rinite allergica. La nostra ricerca intende analizzare quali proteine sono associate alla rinite allergica. L'immunofluorescenza multicolore è attualmente utilizzata per far progredire la ricerca nel nostro campo.In studi futuri, ci concentreremo sui possibili meccanismi della MTC nel trattamento della rinite allergica.

immunofluorescent-labeling-nasal-mucosa-tissue-sections-allergic

Research

JoVE Journal

Medicine

Immunofluorescent Labeling in Nasal Mucosa Tissue Sections of Allergic Rhinitis Rats via Multicolor Immunoassay

1.1K Views.  Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine. La nostra ricerca principale si basa su uno studio sulla rinite allergica. La nostra ricerca intende analizzare quali proteine sono associate alla rinite allergica. L'immunofluorescenza multicolore è attualmente utilizzata per far progredire la ricerca nel nostro campo.In studi futuri, ci concentreremo sui possibili meccanismi della MTC nel trattamento della rinite allergica.

Video: Autore in primo piano: Avanzamento della ricerca sulla rinite allergica con l'immunofluorescenza multicolore

Allergic rhinitis (AR) is a chronic, non-infectious inflammatory disease of the nasal mucosa, primarily mediated by specific immunoglobulin E (IgE), affecting approximately 10%-20% of the world's population. While immunofluorescence (IF) staining has long been a standard technique for detecting disease-specific protein expression, conventional IF techniques are limited in their ability to detect the expression levels of three or more proteins in the same sample. Consequently, multicolor IF techniques have been developed in recent years, which allow the simultaneous labeling of multiple targets in cells or tissues.
This protocol provides a comprehensive overview of the process for establishing a rat model of AR, obtaining nasal mucosal samples, and the technical procedures for multicolor immunofluorescence. All rats in the AR group exhibited typical symptoms such as sneezing, a runny nose, and an itchy nose, with behavioral observations scoring &#8805;5 points. Hematoxylin and eosin (H&amp;E) staining revealed increased inflammatory cell counts and disrupted nasal mucosal integrity in the AR group. Multicolor immunofluorescence (mIF) demonstrated increased expression of ROR&#947;t and TICAM-1, while Foxp3 expression decreased in the nasal mucosa tissue of AR rats.

This protocol describes a multicolor immunofluorescence technique for evaluating the rat model of allergic rhinitis.

Ricerca

Medicina

Acquisition and Pre-Processing of Nasal Mucosal Samples from Rats with Allergic Rhinitis

To begin, with a scalpel, make a precise incision along the two corners of the mouth of a euthanized rat to expose the muscle tissue. Use a pair of tissue scissors to cut the joints of the zygomatic bone and the mandible on both sides of the skull. Then remove the mandible.Use tissue scissors to cut the bony connection between the nasal cavity and the maxilla. Then use a hemostat to separate the skin of the maxilla to expose the nasal cavity. Sever the connection between the nasal cavity and the orbital bones on both sides at the infraorbital foramen, and remove the nasal cavity.Place the extracted nasal cavity in a 4%Paraformaldehyde solution for fixation. To decalcify the tissue, wash the fixed tissue with distilled water. Place the tissues in a decalcification solution with a volume 20 to 30 times that of the tissues at room temperature.Once decalcification is complete, place the tissue in a dehydration box. Transfer the dehydration box to a dehydrator and dehydrate the tissue in increasing alcohol concentrations at different incubation times. Next, place the tissue in anhydrous ethanol for 30 minutes for two cycles.Following this, transfer the tissue to xylene for five to 10 minutes and repeat, then immerse the tissue in wax for one hour. Place the wax block in embedding cassettes. Remove the wax blocks after they have solidified and trim the wax block.Insert the trimmed wax block into a paraffin microtome and cut it into three micrometer thick slices. Hematoxylin and eosin staining of the control rats showed well arranged and cilia. The nasal septum mucosa was damaged and detached in the disease group with notable neutrophil infiltration.

Acquisizione e pre-elaborazione di campioni di mucosa nasale da ratti con rinite allergica

Multicolor Immunostaining of Nasal Mucosal Tissues of Rats with Allergic Rhinitis

To begin, place the hematoxylin and eosin stained rat nasal mucosal tissue sections onto a microscope stage. Adjust the microscope's focus until the image is clearly visible. Capture the tissue image at 40X.Heat the citrate phosphate buffer until it boils. Then add the slides to the container after removing it from the heat. After heating for eight minutes until boiling, turn off the heat for eight minutes and subsequently switch to medium low heat for seven minutes.After allowing the container to cool naturally transfer the slices to PBS. Use a decolorizing shaker to shake the slices for five minutes. Next draw a circle around the dried tissue with an immunohistochemical pen.Add 3%hydrogen peroxide solution to the slices before incubating. Then transfer the slices to PBS for washing as before. To block, apply 5%goat serum within the marked circle.After incubation, carefully remove the blocking solution and add one to two milliliters of FOXP3 to the tissue slices. Then place the slices in a humid chamber for overnight incubation. After washing the slices in PBS, gently dab the slices dry with filter paper.Then add one to two milliliters of the secondary antibody solution to the slices. Next incubate the slices in 100 microliters of tyramide signal amplification working solution for 10 minutes at room temperature in the dark. After incubation, wash the slices with PBS three times for five minutes each.Now apply one to two milliliters of DAPI staining solution to the slices before incubation. Quench the auto fluorescence by incubating the slices in the quencher for five minutes before a 10 minute PBS wash. Then seal them with the anti fluorescence quencher.Capture the microscopic images of the stained sections under 20X and 40X magnification. Hematoxylin and eosin staining of the control rats showed well arranged epithelial cells and cilia. The nasal septum mucosa was damaged and detached in the disease group with notable neutrophil infiltration.Multi immunofluorescent staining revealed that the expressions of ROR Gamma T and TCAM1 were increased in the disease group. However, FOXP3 was under expressed.