Haemophilus influenza es una causa importante de inflamación en diversas enfermedades pulmonares crónicas, como la EPOC y la neumonía. Este protocolo describe métodos para evaluar el efecto de haemophilus sobre la inflamación pulmonar. Las ventajas de esta técnica es que permite una evaluación exhaustiva de las respuestas inmunes innatas y adaptativas.
Incubar 450 microlitros de sangre periférica con 50 microlitros de un yoduro de propidio activado marcado con H influenzae en un tubo de cinco mililitros durante 20 minutos en un baño maría a 37 grados centígrados. Retire la muestra del baño maría, agregue cinco microlitros de DHR y vórtice durante 10 segundos. Luego colóquelo de nuevo en el baño de agua durante otros 10 minutos.
Después de retirar la muestra del baño de agua, lisar los eritrocitos con cinco mililitros de solución de cloruro de amonio al 0,8% y analizar las muestras en un citómetro de flujo como se describe en el texto. Dividir la muestra de sangre periférica en alícuotas para el control y la estimulación del antígeno. Agregue anticuerpos coestimuladores a ambas muestras.
Luego agregue el H influenzae no tipificable a la muestra de antígeno e incube a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante una hora. A continuación, agregue el agente bloqueador de Golgi brefeldin A a las muestras e incubarlas durante otras cinco horas. Después de lisar los eritrocitos como se demostró anteriormente, fijar los leucocitos utilizando 500 microlitros de uno a 2% de para-formaldehído durante una hora.
Cuente las células con un hemocitómetro, luego permeabilice 1 millón de células con 100 microlitros de saponina al 0,1% durante 15 minutos. A continuación, incubar las células con anticuerpos marcados con fluorescencia apropiados. Lave las células, luego analícelas con un citómetro de flujo.
Determinar la proporción de células que responden al antígeno obteniendo las poblaciones de linfocitos relevantes. Realizar tinción de fondo en células no estimuladas para todas las citoquinas a analizar. Corte alrededor de 20 a 40 gramos de la muestra de lobectomía en tres a cinco secciones milimétricas cúbicas.
Colóquelos dentro de una cámara estéril de 50 microlitros y fragmente mecánicamente el tejido utilizando un desagregador apropiado. Después de la desagregación tisular, lisar los glóbulos rojos como se demostró y resuspender las células en RPMI estéril. Luego filtre las células a través de una malla de nylon estéril de 100 micrómetros y cuente las células viables utilizando el método de exclusión de azul de tripano.
Para el ensayo de infección, resuspender las células pulmonares en RPMI a una concentración final de 4 millones de células por mililitro por tubo. Luego infectar las células a un MOI de 100 bacterias por célula. Afloje la tapa media rotación para permitir la transferencia de gas en los tubos.
Coloque las células en el rotador del tubo e incubarlas a 37 grados centígrados mientras gira a 12 RPM. Una hora después de la estimulación, agregue grefeldina A para evitar la exportación extracelular de citoquinas e incube las suspensiones celulares durante otras 16 a 22 horas con rotación. Al día siguiente, lave la suspensión celular con 500 microlitros de PBS que contengan 1% de albúmina sérica bovina y 0,01% de azida de sodio.
A continuación, tiñe la suspensión celular para marcadores específicos de superficie celular de linfocitos humanos durante una hora. Luego lave las células con PBS y fíjelas y permeabilícelas como se demostró anteriormente. A continuación, incubar las células con anticuerpos de tinción de citoquinas intracelulares durante una hora.
Luego lave las células y resuspenda en 100 microlitros de PBS antes de la adquisición de datos en un citómetro de flujo. Mida la proteólisis a través de la acción de las metaloproteinasas, agregue sustrato de gelatina marcado con fluoresceína directamente en los portaobjetos de la sección de tejido pulmonar. Coloque los portaobjetos horizontalmente e incubarlos en una cámara humidificada protegida por la luz a 37 grados centígrados durante una hora.
Para preparar controles negativos, agregue un tampón de reacción x sin gelatina fluorescente a las secciones para su posterior análisis. Las células mononucleares de sangre periférica se cerraron utilizando dispersión hacia adelante y hacia los lados para definir la población de fagocitos. La población de fagocitos se definió aún más por la expresión de CD14 para marcar los monocitos.
La medición de ROS se realizó mediante oxidación de DHR 123 para producir fluorescencia. La mediana de fluorescencia de la muestra estimulada se comparó con el control. La producción de citoquinas intracelulares por los linfocitos se midió mediante citometría de flujo.
Las células se analizaron primero por su expresión del marcador leucocitario CD45 y luego para el CD tres y el CD cuatro, CD ocho. Las células positivas CD tres, CD cuatro se evaluaron para la producción intracelular de citoquinas en muestras de control y estimuladas. La actividad de la proteasa se midió mediante dos zimografías NC en secciones de tejido pulmonar no fijadas.
La tinción fluorescente indicó la presencia de actividad MMP, que también se colocalizó con la expresión de cromatina. La adición de anticuerpos a las muestras de tejido pulmonar requiere concentración y la tinción de las células requerirá optimización en experimentos preliminares. El sobrenadante de las muestras de tejido pulmonar se puede analizar más a fondo para otros mediadores inflamatorios utilizando técnicas como ELISA y Estas técnicas se pueden utilizar para evaluar el efecto de las terapias potenciales sobre la inflamación pulmonar.
