Este protocolo proporciona configuraciones experimentales para realizar cocultivos 2D y 3D controlables en microdispositivos para visualizar y monitorear diafonías entre células tumorales e inmunes y analizar los efectos de los tratamientos contra el cáncer. Esta tecnología proporciona una visualización fácil y en tiempo real del reclutamiento y las interacciones de las células inmunes y se puede emplear para muestras humanas y derivadas de pacientes. Es compatible con la mayoría de las microscopías de última generación.
Demostrando el procedimiento estarán Francesco Noto, estudiante de doctorado en el Departamento de Oncología y Medicina Molecular, Istituto Superiore di Sanita, y Nicoleta Manduca y Esther Maccafeo, estudiantes de doctorado en la Universita Cattolica del Sacro Cuore, Departamento de Medicina Traslacional y Cirugía. Las virutas se activan previamente por plasma en un limpiador de plasma o en una máquina de grabado de hierro reactivo en sala limpia. Las células murinas del bazo y una línea celular tumoral se utilizan aquí para imitar los protocolos descritos en el texto.
Antes de cargar las suspensiones celulares, retire los medios de los seis depósitos. Luego, cargue lentamente 1 x 10 a las 5ª células tumorales resuspendidas en 10 a 50 microlitros de medio de crecimiento en el reservorio superior izquierdo y en el pozo inferior. En el lado derecho, pipetear suavemente 1 x 10 a las 6ª células inmunes flotantes resuspendidas en 50 microlitros de medio de crecimiento en dos pocillos.
Cuando se hayan agregado todas las células, llene los seis depósitos de cada chip con hasta 100 a 150 microlitros de medio de crecimiento y verifique que las células se hayan distribuido correctamente dentro de cada compartimiento de cultivo. Incubar el chip durante una hora para permitir que el sistema se estabilice antes de la grabación de lapso de tiempo. Para obtener imágenes de células vivas, monte el tumor inmune en la placa de chip en la etapa del microscopio.
Personalice la configuración del flujo de trabajo de adquisición en la interfaz del software del microscopio, como el software Incucyte Live-Cell Analysis. Seleccione las ventanas de observación, la velocidad de fotogramas óptima y la duración del tiempo, dependiendo de los parámetros apropiados para el experimento y los tipos de células en estudio. Imagen de las celdas para el período de tiempo experimental apropiado.
Preparar dos alícuotas de matrigel diluido con medio que contenga un fármaco o una combinación de fármacos para las dos condiciones experimentales utilizando puntas frías. Pipetear suavemente células tumorales teñidas con colorante fluorescente compatibles con vivos suspendidas en solución de matriz sobre hielo para obtener una distribución homogénea de las células. Con la placa de chip en un bloque de enfriamiento o en una canasta con hielo, inyecte lentamente la solución de matriz de células tumorales tratada con medicamentos en los puertos de gel izquierdo y derecho con puntas frías de micropipeta de 10 microlitros.
Aplique una presión suave para empujar la solución de matriz de un lado del canal al otro. Cuando se hayan cargado todas las células tumorales, coloque el dispositivo en la incubadora en posición vertical durante 30 minutos. Al final de la incubación, una vez que se complete la gelificación de la matriz, llene los canales del medio de los seis reservorios con 50 microlitros de medio de cultivo.
Verifique la integridad del gel polimerizado y la distribución de las células tumorales bajo un microscopio. Luego coloque los chips en una incubadora hasta que se complete la preparación de las células inmunes. Después de la incubación, aspire el medio de cada pozo.
Coloque la punta cerca de la entrada del canal medio medio y use una presión moderada para inyectar suavemente 10 microlitros de 10 a las 6ª células inmunes marcadas con un tinte fluorescente contrastante. Inyecte de 50 a 100 microlitros del medio en cada uno de los cuatro pocillos de los canales laterales, de 40 a 90 microlitros del medio en el pozo central superior y de 50 a 100 microlitros del medio en el pozo central inferior. Cuando todos los pocillos hayan sido cargados, use un microscopio para confirmar que la distribución de células inmunes ha permanecido confinada a la cámara central.
Luego, coloque cuidadosamente el dispositivo en una superficie nivelada en la incubadora de cultivo celular hasta que se le dé una imagen. Para calcular la extensión de las células inmunitarias vivas teñidas con fluorescencia que se infiltran en los compartimentos tumorales, obtenga imágenes del dispositivo en puntos de tiempo específicos de interés mediante microscopía de fluorescencia y configure los parámetros de cámara apropiados en el software de imágenes del microscopio, como Nikon NIS-Elements. También establezca los parámetros para las células inmunes marcadas.
El movimiento de los leucocitos a través de puentes de microcanales construidos adecuadamente en la plataforma microfluídica hacia sus células diana puede rastrearse mediante microscopía de video. En este análisis de seguimiento, las PBMC individuales fueron desafiadas con células cancerosas muertas tratadas con doxorrubicina o vivas tratadas con PBS. Los valores relevantes de quimiotaxis y las gráficas de migración se generaron automáticamente, y se observó un perfil migratorio diferente para las células inmunes cuando se cocargaron con células de cáncer de mama expuestas a doxorrubicina o PBS.
Cuando las PBMC se enfrentaron a células cancerosas apoptóticas, cruzaron microcanales hacia las células moribundas y muertas, pero no cruzaron a células vivas no tratadas. Una fracción de leucocitos con densidad creciente durante 24 a 48 horas exhibieron contactos a largo plazo con células cancerosas tratadas con doxo. En este análisis, se utilizó un nuevo modelo tumoral inmunocompetente 3D para cuantificar el reclutamiento de células inmunes en respuesta a combinaciones de fármacos epigenéticos contra el cáncer.
Las PBMC marcadas con colorante rojo se distribuyeron homogéneamente en la cámara fluídica central. Luego se comparó la capacidad de las dos masas tumorales para atraer a las PBMC, y las PBMC se reclutaron robustamente en este experimento en el microcanal del lado derecho. Para el modelo 3D, mezcle la solución con hidrogel y células sobre hielo, evitando burbujas y prepolimerización.
Inyéctelo lentamente sin presión excesiva. Ajuste los pasos de polimerización de acuerdo con la matriz utilizada. Se pueden implementar ensayos de células vivas / muertas y perfiles de secreción de citoquinas de sobrenadantes.
La inmunofluorescencia para imágenes confocales se puede realizar para clasificar subtipos inmunes y para marcadores de expresión de activación y maduración de agotamiento.
