F.L.Q. agradece el apoyo del Programa Pionero de Investigación y Desarrollo de Zhejiang (2022C03031), el Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China (2021YFA0910103), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (22274141, 22074080), la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Shandong (ZR2022ZD28) y el Programa de Becarios Taishan de la Provincia de Shandong (tsqn201909106). H.C. agradece el apoyo financiero de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82202329). Los autores reconocen el uso de instrumentos en la Instalación Central de Instrumentación Compartida en el Instituto de Medicina de Hangzhou (HIM) de la Academia China de Ciencias.

Este estudio no requiere autorización ética, ya que la piel de cerdo utilizada para los experimentos descritos en la sección 3 se compró como orejas de cerdo comestibles en el mercado y no se obtuvo de animales de experimentación.
1. Aislamiento de exosomas
<ol><li>Cultivo celular<ol><li>Cultive células de cáncer epitelial de ovario de ratón ID8 en el medio de cultivo Eagle Medium Modified (DMEM) de Dulbecco que contiene un 10% de suero fetal bovino y una solución de penicilina-estreptomicina al 1% (100×) (ver Tabla de Materiales) en placas de Petri con un diámetro de 15 cm.</li>
		<li>Incubar las células ID8 en una incubadora de CO2 (ver Tabla de Materiales) a 37 °C y 5% de CO2 hasta que la densidad celular alcance el 90%.</li>
	</ol></li>
	<li>Aislamiento de exosomas<ol><li>Retire el medio de cultivo de las placas de Petri y lávelas dos veces con solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco. Añadir 20 mL de DMEM sin suero fetal bovino (ver Tabla de Materiales) y solución de penicilina-estreptomicina (ver Tabla de Materiales). Continuar la incubación a 37 °C y 5% de CO2 durante 48 h.</li>
		<li>Recoja el sobrenadante de cultivo celular de 20 placas de Petri de 15 cm de diámetro. Centrifugar a 300 x g durante 10 min a 4 °C y recoger el sobrenadante para eliminar las células libres.</li>
		<li>Centrifugar a 2000 x g durante 10 min 4 °C y recoger el sobrenadante para eliminar los restos celulares.</li>
		<li>Conecte el sistema de filtración al vacío desechable de 0,22 μm (consulte la tabla de materiales) a la bomba de vacío de agua circulante (consulte la tabla de materiales). Cree un vacío para permitir que el sobrenadante pase a través de la membrana de poliéter sulfona de 0,22 μm y entre en la cámara inferior del sistema de filtración, eliminando eficazmente las vesículas o impurezas mayores de 0,22 μm del sobrenadante.<ol><li>Para conectar la bomba de vacío, encienda el interruptor de la bomba y luego conéctelo a la entrada de aire del sistema de filtración al vacío. Al cerrar, desconecte primero la conexión con la bomba y luego apague la bomba de vacío. Este procedimiento ayuda a evitar el reflujo de la bomba de vacío y la contaminación del fluido de cultivo.</li>
		</ol></li>
		<li>Añadir 15 mL de sobrenadante al tubo interior del tubo de ultrafiltración de 100 kDa (ver Tabla de Materiales). Centrifugar a 3500 x g durante 10 min a 4 °C y retirar el líquido del tubo exterior. NOTA: Retenga las partículas de más de 100 kDa en la membrana del tubo interior, mientras que las proteínas de menos de 100 kDa se centrifugarán al tubo exterior junto con la solución. Los exosomas eran mayores de 100 kDa y se agregaron en la membrana del tubo interno.</li>
		<li>Repita los pasos anteriores hasta que el volumen total del líquido esté dentro de los 5 ml. Recoja el líquido de la cámara de aire y agregue 1 ml de DPBS. Utilice una pipeta para pipetear repetidamente en el tubo interior, asegurando la resuspensión de los exosomas adjuntos en DPBS, y luego recójalos.</li>
		<li>Centrifugar a 10000 x g durante 60 min a 4 °C y transferir el sobrenadante a un tubo de centrífuga de 6 mL de cierre rápido (ver Tabla de Materiales). Selle el tubo con un sellador térmico.</li>
		<li>Centrifugar a 100.000 x g durante 2 h 4 °C utilizando una ultracentrífuga (ver Tabla de Materiales). Abra el tubo de centrífuga de cierre rápido, retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 100 μL de DPBS. Esta es la solución del exosoma. NOTA: Durante el proceso de resuspensión del pellet, es necesario pipetear y agitar la pared del tubo al menos 200 veces con una pipeta.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Fabricación de exo@MN
<ol><li>Preparación del molde maestro<ol><li>Construya un modelo de microaguja con una matriz de 10 x 10 utilizando software CAD, con puntas de forma cónica con los siguientes parámetros: una altura de 1200 μm, un diámetro de base de 400 μm y un paso (distancia entre microagujas adyacentes) de 900 μm.</li>
		<li>Utilice resina HTL como material e imprima el molde maestro de la microaguja utilizando una impresora 3D (ver Tabla de Materiales).</li>
		<li>Sumerja el molde maestro en etanol absoluto durante 1 h para eliminar cualquier resina adherida a la superficie.</li>
		<li>Exponga el molde a la luz ultravioleta durante 5 minutos para que se seque.</li>
		<li>Sumergir el molde una vez más en etanol absoluto durante 1 h, seguido de un secado a 60 °C en un horno de secado durante 1 h. El molde maestro está listo.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación del molde de producción<ol><li>Mezcle los componentes A y B del polidimetilsiloxano (PDMS, consulte la tabla de materiales) en una proporción de 10:1. Remueve bien y vierte la mezcla en un molde maestro.</li>
		<li>Coloque el molde de PDMS a una presión de 1 psi durante 15 minutos para eliminar las burbujas de aire de la mezcla de PDMS.</li>
		<li>Curar el molde de PDMS a 60 °C durante 2 h y luego desmoldar para obtener el molde de producción de la microaguja.</li>
		<li>Limpie el molde de producción con agua ultrapura antes de usarlo.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación de la solución<ol><li>Cuantifique el contenido de proteínas de la solución de exosomas utilizando un kit de ensayo de BCA (consulte la tabla de materiales). Agregue una cantidad adecuada de DPBS para lograr una concentración de 10 μg/μL para la solución de exosomas.</li>
		<li>Prepare una solución de 200 mg/mL de trehalosa (ver Tabla de Materiales) utilizando DPBS como solvente. Revuelva durante 20 minutos para asegurar una disolución completa.</li>
		<li>Prepare una solución de 200 mg/mL de ácido hialurónico (AH, ver Tabla de Materiales) utilizando DPBS como disolvente. Revuelva durante la noche para asegurar la disolución completa.</li>
		<li>Prepare una solución de 150 mg/mL de polivinilpirrolidona (PVP, ver Tabla de Materiales) utilizando etanol absoluto como solvente. Revuelva durante la noche para asegurar la disolución completa.</li>
		<li>Mezclar la solución de exosomas (10 μg/μL) y la solución de trehalosa (200 mg/mL) en una proporción de volumen de 1:1. Luego, agregue un volumen igual de solución de HA (200 mg / mL). Mezcle bien para obtener la solución de punta.</li>
	</ol></li>
	<li>Fabricación de exo@MN<ol><li>Procese la superficie del molde de PDMS utilizando un limpiador de plasma (ver Tabla de Materiales) durante 30 s a un grado bajo para mejorar su hidrofilicidad.</li>
		<li>Añada 40 μL de la solución de puntas al molde de PDMS. Centrifugar a temperatura ambiente (RT) y 3000 x g durante 3 min para asegurar que el líquido llene la capa de agujas del molde.</li>
		<li>Retirar el exceso de líquido del molde y secar a RT en un horno de secado al vacío (ver Tabla de Materiales) durante 1 día.</li>
		<li>Agregue 200 μL de solución de PVP al molde de PDMS. Centrifugar 3000 x g durante 3 min en RT para asegurarse de que el líquido llene la capa de soporte del molde.</li>
		<li>Seque el molde en RT en un horno de secado durante 1 día, luego desmolque para obtener el parche exo@MN. NOTA: Mantenga el parche de exo@MN almacenado en un horno de secado hasta que esté listo para usar.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67109/67109fig01.jpg"> Figura 1: Proceso de fabricación de exo@MN parches. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67109/67109fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
3. Caracterización de exo@MN parches
<ol><li>Observación de la morfología<ol><li>Pegue el reverso del parche sobre una superficie inclinada 45° y colóquelo bajo un microscopio estereoscópico (consulte la tabla de materiales).</li>
		<li>Enciende el iluminador y captura la morfología del parche con un objetivo 4x.</li>
	</ol></li>
	<li>Microscopía electrónica de barrido (SEM)<ol><li>Fije el parche a la etapa de muestra con adhesivo conductor y trátelo con un recubridor fino automático (consulte la tabla de materiales) durante 30 s.</li>
		<li>Capture imágenes del parche exo@MN utilizando SEM (ver Tabla de Materiales) con un voltaje de aceleración de 1 kV.</li>
	</ol></li>
	<li>Ensayos mecánicos<ol><li>Corte una matriz de 3 x 3 del parche y colóquela con las puntas hacia arriba en la plataforma rígida de un medidor de tracción (consulte la tabla de materiales). Ajuste la altura de la sonda para acercarla a las puntas de las agujas sin tocarlas.</li>
		<li>Ajuste los parámetros para que se detengan cuando la presión alcance los 20 N automáticamente. Comprima las puntas de las agujas verticalmente a una velocidad de 0,5 mm/min y registre el perfil de carga frente al desplazamiento.</li>
	</ol></li>
	<li>Disolución<ol><li>Compra orejas de cerdo frescas en el mercado y córtalas en trozos (5 cm x 5 cm x 0,3 cm). Extienda la piel de cerdo sobre una mesa y use papel para secar la humedad de la superficie.</li>
		<li>Prepare cuatro parches secos de microagujas con las puntas de las agujas hacia abajo sobre la piel del cerdo, espaciando ligeramente cada parche. Con los dedos pulgar e índice, presione verticalmente cada parche de microaguja. Retire un parche cada 15 s.</li>
		<li>Coloque inmediatamente el parche retirado en un horno de secado y seque durante 5 min. Corte una columna de puntas de microagujas, colóquelas horizontalmente debajo de un microscopio (consulte la Tabla de materiales) y use una lente de objetivo de 4x para observar la disolución de las puntas.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Caracterización de exosomas en exo@MN parche
NOTA: Las puntas de las microagujas de exo@MN se disuelven en 100 μL de solución de DPBS para realizar la siguiente caracterización de los exosomas liberados.
<ol><li>Microscopía electrónica de transmisión (TEM)<ol><li>Trate la malla de cobre (ver Tabla de Materiales) con un tratamiento hidrofílico usando un limpiador de iones (ver Tabla de Materiales) durante 5 min.</li>
		<li>Dispense 10 μL de la muestra en el lado de carbono de la malla de cobre. Déjalo reposar durante 1 minuto, luego retira el líquido secándolo con papel de filtro por los bordes.</li>
		<li>Añadir 10 μL de acetato de uranilo al 3% (ver Tabla de Materiales) a la muestra. Déjalo reposar durante 10 s, luego retira el líquido secando con papel de filtro de los bordes.</li>
		<li>Añadir 10 μL de acetato de uranilo al 3% a la muestra. Déjalo reposar durante 1 minuto, luego retira el líquido secándolo con papel de filtro por los bordes y sécalo al aire RT.</li>
		<li>Captura de imágenes de los exosomas utilizando TEM (ver Tabla de Materiales) con un voltaje de aceleración de 80 kV.</li>
	</ol></li>
	<li>Análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA)<ol><li>Diluya la solución de exosomas con DPBS para lograr una concentración de partículas de 1 x 107 partículas/mL. Inyecte lentamente 1 mL de la solución de exosoma en la cámara de muestra del NTA utilizando una jeringa de 1 mL (ver Tabla de Materiales).</li>
		<li>Establezca el tipo de procedimiento operativo estándar (SOP) del instrumento en EV-488 para detectar la distribución del tamaño de los exosomas.</li>
	</ol></li>
	<li>Western blot (WB)<ol><li>Prepare el tampón de lisis mezclando el tampón de lisis del ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA): fluoruro de fenilmetanosulfonilo (ver Tabla de Materiales) en una proporción de 100:1. Lise los exosomas en hielo durante 20 minutos, vórtices cada 10 minutos.</li>
		<li>Centrifugar la solución a 12.000 x g durante 10 min a 4 °C. Recoja el sobrenadante para medir la concentración de proteínas.</li>
		<li>Agregue 5 veces el tampón de carga SDS-PAGE (consulte la Tabla de materiales) al sobrenadante en una proporción de volumen de 1 : 4 y mezcle bien. Calentar a 100 °C durante 10 min para desnaturalizar las proteínas.</li>
		<li>Añadir 5 μL de un marcador de proteína preteñido de 180 kDa (ver Tabla de Materiales) y 10 μg de muestra desnaturalizada a un gel prefabricado al 4%-20% (ver Tabla de Materiales). Haga funcionar el sistema de electroforesis (consulte la tabla de materiales) a 60 V durante 10 min y luego a 140 V durante 50 min.</li>
		<li>Transfiera las proteínas del gel a una membrana de PVDF (ver Tabla de Materiales) preactivada con metanol. Realizar el sistema de electroforesis a 290 mA durante 90 min en hielo.</li>
		<li>Incubar la membrana de PVDF en una solución de leche desnatada al 5% durante 1 h. Lave tres veces con solución salina tamponada tris con interpolación (TBST, consulte la Tabla de materiales) durante 5 minutos cada una.</li>
		<li>Corta las bandas objetivo en función de la posición de la proteína. Incubar las bandas con el anticuerpo anti-ratón CD63 y el anticuerpo anti-ratón Alix (ver Tabla de Materiales) diluidos a la concentración adecuada de acuerdo con las instrucciones del fabricante, e incubar durante la noche a 4 °C.</li>
		<li>Lave las bandas tres veces con TBST. Incubar con IgG anti-conejo conjugada con HRP (ver Tabla de Materiales) en RT durante 1 h. A continuación, vuelva a lavar tres veces con TBST.</li>
		<li>Aplique un reactivo de detección de súper ECL (consulte la Tabla de materiales) para cubrir la superficie de las bandas, y exponga y capture inmediatamente las bandas con un generador de imágenes en gel (consulte la Tabla de materiales).</li>
	</ol></li>
	<li>Microscopía de barrido láser confocal (CLSM)<ol><li>Cultive 5 x 105 DC en un plato confocal utilizando 2 mL de medio Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) (ver Tabla de Materiales). Añadir exosomas o exo@MN, e incubar a 37 °C durante 24 h.</li>
		<li>Añada una gota de Hoechst 33342 a cada placa confocal e incube en la oscuridad a 37 °C durante 20 min.</li>
		<li>Realice imágenes con un CLSM (consulte la Tabla de materiales) utilizando una lente de objetivo de 60x. Aplique una gota de aceite de inmersión (consulte la tabla de materiales) sobre la lente y coloque la placa confocal sobre la plataforma. Ajuste los ejes x/y/z para localizar el plano focal adecuado de las células.</li>
		<li>Inicie la generación de imágenes con canales DAPI/TRITC/TD, seleccione una resolución de 1024 px y establezca el modo rápido en 1/8 s.</li>
	</ol></li>
	<li>Citometría de flujo<ol><li>Cultive las CD en una placa de 6 pocillos, cada pocillo contiene 5 x 105 celdas y 2 mL de medio 1640. Añadir volúmenes iguales de solución de DPBS, exosomas, microagujas sin exosomas y exo@MN, respectivamente, e incubar a 37 °C durante 24 h.</li>
		<li>Transfiera el medio de cada pocillo a tubos centrífugos. Centrifugar a 300 x g durante 3 min a 4 °C y retirar el sobrenadante.</li>
		<li>Agregue 0,5 μL de anticuerpo FITC-CD11c, 2,5 μL de anticuerpo APC-CD80 y 0,5 μL de anticuerpo Pacific Blue I-A/I-E (ver Tabla de Materiales) a 100 μL de solución de BSA al 5% (ver Tabla de Materiales). Mezclar bien, resuspender las células e incubar en una coctelera en hielo y en la oscuridad durante 20 min.</li>
		<li>Añadir 1 mL de DPBS y centrifugar a 300 x g durante 3 min a 4 °C, luego retirar el sobrenadante. Repita el lavado dos veces para eliminar los anticuerpos no unidos y, a continuación, proceda a analizar los canales fluorescentes correspondientes mediante citometría de flujo (ver Tabla de Materiales).<ol><li>En primer lugar, en el diagrama de dispersión FSC-A/SSC-A, dirija la población de células principales como P1. En el diagrama de dispersión SSC-A/SSC-H de la población de células P1, conecte una región P2 cuadrada a lo largo de la diagonal para eliminar las células agregadas.</li>
			<li>Realice análisis de fluorescencia en la población de células P2 utilizando los canales FITC, APC y Pacific Blue. Establezca la condición de parada para recoger 10.000 celdas en la puerta P2.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>5. Análisis estadístico
<ol><li>Expresar datos cuantitativos como medias ± desviaciones estándar (DE). Evalúe la significación estadística utilizando el análisis de prueba t utilizando una aplicación de software de análisis de datos adecuada. Considere valores p inferiores a 0,05 para indicar significación estadística. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001.</li>
</ol>

Parches de microagujas para la administración sostenida de exosomas en aplicaciones biomédicas

<ol>
	<li>Barile, L., Vassalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+Therapy+delivery+tools+and+biomarkers+of+diseases.">Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of diseases.</a> Pharmacol Ther. 174, 63-78 (2017).</li><li>Kalluri, R., Lebleu, V. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microneedle-mediated+vaccine+delivery+to+the+oral+mucosa.">Microneedle-mediated vaccine delivery to the oral mucosa.</a> Adv Healthc Mater. 8 (4), 1801180 (2019).</li><li>Hu, S., Zhu, D., Li, Z., Cheng, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detachable+microneedle+patches+deliver+mesenchymal+stromal+cell+factor-loaded+nanoparticles+for+cardiac+repair.">Detachable microneedle patches deliver mesenchymal stromal cell factor-loaded nanoparticles for cardiac repair.</a> ACS Nano. 16 (10), 15935-15945 (2022).</li><li>Yang, W., Zheng, H., Lv, W., Zhu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+status+and+prospect+of+immunotherapy+for+colorectal+cancer.">Current status and prospect of immunotherapy for colorectal cancer.</a> Int J Colorectal Dis. 38 (1), 266-276 (2023).</li><li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+and+technologies+for+exosome+isolation+and+characterization.">Methods and technologies for exosome isolation and characterization.</a> Small Methods. 2 (9), 1800021 (2018).</li><li>Bosch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trehalose+prevents+aggregation+of+exosomes+and+cryodamage.">Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage.</a> Sci Rep. 6, 36162 (2016).</li><li>Bhattacharyya, M., Jariyal, H., Srivastava, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronic+acid:+More+than+a+carrier,+having+an+overpowering+extracellular+and+intracellular+impact+on+cancer.">Hyaluronic acid: More than a carrier, having an overpowering extracellular and intracellular impact on cancer.</a> Carbohydr Polym. 317, 121081 (2023).</li><li>Chang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryomicroneedles+for+transdermal+cell+delivery.">Cryomicroneedles for transdermal cell delivery.</a> Nat Biomed Eng. 5 (9), 1008-1018 (2021).</li></ol>

H. C., F.L.Q y S.J.M son inventores de una solicitud de patente que se ha presentado sobre la base de los datos de este manuscrito. H.C. es el fundador científico de Medcraft Biotech. Inc.

En la actualidad, los principales métodos de aislamiento de exosomas son la ultracentrifugación, la centrifugación en gradiente de densidad, la ultrafiltración, la precipitación, las perlas magnéticas de inmunoafinidad y la microfluídica24. Debido a la limitada capacidad de carga de las microagujas causada por su pequeño espacio en la punta de la aguja, es necesario aumentar la concentración de exosomas para cargar más. Por lo tanto, elegimos la ultrafiltración para concentrar el sobren...

Los exosomas, que son pequeñas vesículas liberadas por las células en la matriz extracelular, se han propuesto como potenciales bioterapéuticos y vectores de administración de fármacos para el tratamiento de varias enfermedades y cánceres1. Durante su proceso de biogénesis, los exosomas encapsulan varias moléculas biológicamente activas desde el interior de las células, incluidas las proteínas funcionales y los ácidos nucleicos2. Como resultado, cuando son absorbidos por las células receptoras durante el proceso de transporte, los exosomas tienen la capacidad de modular la expresión génica y las funciones celulares en las células diana3. Como una especie de mensajero de información natural, los exosomas se han aprovechado plenamente en la regeneración de tejidos, la regulación inmunitaria y como portadores de entrega4. A través de técnicas de ingeniería, se pueden enriquecer ligandos específicos en la superficie de los exosomas, lo que permite la inducción o inhibición de eventos de señalización en las células receptoras o se dirige a tipos específicosde células 5. Los agentes quimioterapéuticos también pueden cargarse en exosomas para el tratamiento del cáncer6. Además, los exosomas tienen la capacidad de cruzar la barrera hematoencefálica para la entrega de carga terapéutica, lo que los hace muy prometedores para el tratamiento de trastornos cerebrales7. En comparación con los liposomas, los exosomas presentan una mayor absorción celular y una mejor biocompatibilidad8. Son capaces de entrar eficientemente en otras células, al tiempo que demuestran una mejor tolerancia y una menor toxicidad9. Sin embargo, la inyección tradicional en bolo de exosomas es propensa al secuestro y a la rápida eliminación por parte del hígado, los riñones y el bazo enel torrente sanguíneo. Además, los exosomas tienen poca estabilidad in vitro y son susceptibles a condiciones de almacenamiento que restringen sus aplicaciones clínicas11.
Las microagujas, un conjunto de puntas de aguja de tamaño micrométrico, tienen la capacidad de penetrar las barreras fisiológicas para la administración de fármacos de moléculas pequeñas12, proteínas13, ácidos nucleicos14 y nanomedicinas15. Las microagujas están diseñadas con precisión para atacar las lesiones en la superficie de la piel, y sus puntas dispersas garantizan una distribución uniforme del fármaco en el sitio objetivo, amplificando así su impacto terapéutico16. El diseño y la composición del material de las microagujas facilitan el almacenamiento en seco de sustancias bioactivas como proteínas y ácidos nucleicos, mejorando su estabilidad17. Los métodos tradicionales de inyección tienen una duración de acción relativamente corta y pueden causar dolor, induciendo miedo en los pacientes18. La longitud de la microaguja, del tamaño de un micrómetro, minimiza el trauma tisular y evita la estimulación nerviosa, eliminando así el dolor y mejorando la distensibilidad del paciente19. Además, la facilidad de uso de las microagujas permite a los pacientes autoadministrarse el tratamiento sin necesidad de personal especializado16. Además de la piel, las microagujas también se pueden utilizar en tejidos como los ojos20, la mucosa oral21, el corazón22 y los vasos sanguíneos23. La aplicación de microagujas para la administración clínica de exosomas proporciona una estrategia prometedora y prospectiva.
Por lo tanto, presentamos un parche de microagujas (exo@MN) cargado con exosomas y divulgamos su método de fabricación. Los parches de microagujas se fabricaron utilizando un método de fundición de dos pasos, junto con centrifugación y secado al vacío, que promueve la agregación de exosomas en las puntas de las microagujas, mejorando así la eficiencia de la administración. Tanto las puntas de las agujas como el soporte se construyeron con materiales que exhiben una excelente biocompatibilidad y solubilidad en agua. Se incorporaron trehalosa y ácido hialurónico (AH) como materiales de punta para proporcionar protección a los exosomas, y se eligió polivinilpirrolidona (PVP) disuelto en etanol absoluto como material de soporte. La morfología del parche de microagujas se caracterizó mediante microscopía y microscopio electrónico de barrido (SEM). Las pruebas mecánicas de la microaguja se evaluaron utilizando un tensímetro para confirmar su capacidad para penetrar en la piel, y se investigó que la tasa de liberación en la piel de cerdo era de 60 s. Además, se caracterizó la morfología, el tamaño y el contenido de proteínas de los exosomas frescos y de los exosomas en exo@MN mediante microscopio electrónico de transmisión (TEM), análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) y Western blot (WB). La internalización de exosomas por células dendríticas (CD) se caracterizó mediante microscopio láser confocal de barrido (CLSM) y la maduración de las CD se evaluó mediante citometría de flujo. La caracterización morfológica y las funciones biológicas de los dos tipos de exosomas son esencialmente consistentes.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100x penicillin-streptomycin solutions</td>
			<td>Jrunbio Scientific</td>
			<td>MA0110</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>180 kDa pre-stained protein marker</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>26616</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3% Uranyl acetate</td>
			<td>Henan Ruixin Experimental Supplies</td>
			<td>GZ02625</td>
			<td>Morphological characterization of exosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D printer</td>
			<td>BMF technology</td>
			<td>nanoArch S130</td>
			<td>Mold preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4%&#8211;20% precast gel</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>ExpressPlus PAGE GEL</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#215; SDS-PAGE loading buffer</td>
			<td>Titan</td>
			<td>04048254</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Alix antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>12422-1-AP</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD63 antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>ab217345</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD80 antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>104713</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Auto fine coater</td>
			<td>ZIZHU</td>
			<td>JBA5-100</td>
			<td>Morphological characterization of microneedle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA assay kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0012</td>
			<td>Protein concentration assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Muitifuge X1R pro</td>
			<td>Cell centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circulating water vacuum pump</td>
			<td>Yuhua Instrument</td>
			<td>SHZ-D(III)</td>
			<td>Filtration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>CellXpert C170</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>A1HD25</td>
			<td>Fluorescence imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper mesh</td>
			<td>Beijing Zhongjingkeyi Technology&#160;</td>
			<td>JF-ZJKY/300</td>
			<td>Morphological characterization of exosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D- (+) -Trehalose dihydrate</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>5138-23-4</td>
			<td>Fabrication of microneedle&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium</td>
			<td>Meilunbio</td>
			<td>MA0212</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s phosphate-buffered saline</td>
			<td>Meilunbio</td>
			<td>MA0010</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis system</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>PowerPac-basic</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Jrunbio Scientific</td>
			<td>JR100</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-mouse CD11c antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>117305</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometry</td>
			<td>BD</td>
			<td>LSR Fortessa</td>
			<td>Fluorescence detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imager</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>Amersham ImageQuant 800</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP-conjugated anti-rabbit IgG</td>
			<td>CST</td>
			<td>7074S</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HTL resin</td>
			<td>BMF technology</td>
			<td></td>
			<td>Mold preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronic acid (MW = 300 kDa)</td>
			<td>Bloomage Biotechnology</td>
			<td>9004-61-9</td>
			<td>Fabrication of microneedle&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion oil</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MXA22168</td>
			<td>Fluorescence imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion cleaner</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>EC-52000IC</td>
			<td>Morphological characterization of exosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX53</td>
			<td>Observe the microneedle tip dissolving process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse ovarian epithelial cancer cell ID8</td>
			<td>MeisenCTCC</td>
			<td>&#160;CC90105</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoparticle tracking analysis</td>
			<td>Particle Metrix</td>
			<td>ZetaView</td>
			<td>Size analysis of exosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue anti-mouse I-A/I-E antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>107619</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST507</td>
			<td>Protease inhibitors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Hefei Kejing Material Technology</td>
			<td>PDC-36G</td>
			<td>Fabrication of microneedle&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>9016-00-6</td>
			<td>Mold preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylpyrrolidone (MW = 40 kDa)</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>9003-39-8</td>
			<td>Fabrication of microneedle&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism&#160;</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>Version 9</td>
			<td>Statistical analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-snap centrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>344619</td>
			<td>Exosomes extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA lysis buffer</td>
			<td>Applygen</td>
			<td>C1053</td>
			<td>Lysis membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell park memorial institute 1640</td>
			<td>Meilunbio</td>
			<td>MA0548</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning electron microscope</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>JSM-IT800</td>
			<td>Morphological characterization of microneedle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX16</td>
			<td>Characterization of morphology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super ECL detection reagent</td>
			<td>Applygen</td>
			<td>P1030</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tensile meter</td>
			<td>Instron</td>
			<td>68SC-05</td>
			<td>Mechanical testing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscope</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>JEM-2100plus</td>
			<td>Morphological characterization of exosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris buffered saline</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>JF-A500027-0004</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST825</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>Optima XPN-100</td>
			<td>Exosomes extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrafiltration tube</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC910096</td>
			<td>Exosomes concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum drying oven</td>
			<td>Shanghai Yiheng Technology</td>
			<td>DZF-6024</td>
			<td>Fabrication of microneedle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum filtration system</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BS-500-XT</td>
			<td>Filtration</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication and characterization of microneedle patches for loading and delivery of exosomes

Los exosomas, como bioterapéuticos emergentes de "próxima generación" y vectores de administración de fármacos, tienen un inmenso potencial en diversos campos biomédicos, que van desde la administración de fármacos y la medicina regenerativa hasta el diagnóstico de enfermedades y la inmunoterapia tumoral. Sin embargo, el rápido aclaramiento mediante la inyección tradicional en bolo y la escasa estabilidad de los exosomas restringen su aplicación clínica. Las microagujas sirven como una solución que prolonga el tiempo de residencia de los exosomas en el sitio de administración, manteniendo así la concentración del fármaco y facilitando efectos terapéuticos sostenidos. Además, las microagujas también poseen la capacidad de mantener la estabilidad de las sustancias bioactivas. Por lo tanto, presentamos un parche de microagujas para cargar y administrar exosomas y compartimos los métodos, incluido el aislamiento de exosomas, la fabricación y la caracterización de parches de microagujas cargados con exosomas. Los parches de microagujas se fabricaron utilizando trehalosa y ácido hialurónico como materiales de punta y polivinilpirrolidona como material de soporte a través de un método de fundición de dos pasos. Las microagujas demostraron una resistencia mecánica robusta, con puntas capaces de soportar 2 N. Se utilizó piel de cerdo para simular la piel humana, y las puntas de las microagujas se derritieron completamente dentro de los 60 segundos posteriores a la punción de la piel. Los exosomas liberados por las microagujas mostraron morfología, tamaño de partícula, proteínas marcadoras y funciones biológicas comparables a las de los exosomas frescos, lo que permitió la absorción de las células dendríticas y promovió su maduración.

Exosomes, which are small vesicles released by cells into the extracellular matrix, have been proposed as potential biotherapeutics and drug delivery vectors for the treatment of several diseases and cancers1. During their biogenesis process, exosomes encapsulate various biologically active molecules from within the cells, including functional proteins and nucleic acids2. As a result, when taken up by recipient cells during the transport process, exosomes have the ability to modulate gene expression and cellular functions in the target cells3. As a kind of natural information messenger, exosomes have been fully taken advantage of in tissue regeneration, immune regulation, and as a delivery carrier4. Through engineering techniques, specific ligands can be enriched on the surface of exosomes, enabling the induction or inhibition of signaling events in recipient cells or targeting specific cell types5. Chemotherapeutic agents can also be loaded into exosomes for cancer treatment6. Moreover, exosomes have the ability to cross the blood-brain barrier for therapeutic cargo delivery, making them highly promising for the treatment of brain disorders7. Compared to liposomes, exosomes exhibit enhanced cellular uptake and improved biocompatibility8. They are capable of efficiently entering other cells while demonstrating better tolerance and lower toxicity9. However, the traditional bolus injection of exosomes is prone to sequestration and rapid clearance by the liver, kidneys, and spleen in the bloodstream10. Moreover, exosomes have poor stability in vitro and are susceptible to storage conditions, which restrict their clinical applications11.
Microneedles, an array of micrometric-sized needle tips, have the capability to penetrate physiological barriers for the delivery of small molecule drugs12, proteins13, nucleic acids14, and nanomedicines15. Microneedles are precisely engineered to target lesions on the skin surface, and their dispersed tips ensure uniform drug distribution at the targeted site, thus amplifying their therapeutic impact16. The design and material composition of microneedles facilitate&#160;the dry storage of bioactive substances such as proteins and nucleic acids, enhancing their stability17. Traditional injection methods have a relatively short duration of action and can cause pain, inducing fear in patients18. The micrometer-sized length of microneedle minimizes tissue trauma and prevents nerve stimulation, thereby eliminating pain and improving patient compliance19. Additionally, the user-friendly nature of microneedles allows patients to self-administer the treatment without the need for specialized personnel16. In addition to the skin, microneedles can also be used in tissues such as the eyes20, oral mucosa21, heart22, and blood vessels23. The application of microneedles for the clinical delivery of exosomes provides a promising and prospective strategy.
Hence, we introduce an exosome-loaded microneedle (exo@MN) patch and disclose its fabrication method. The microneedle patches were fabricated using a two-step casting method, along with centrifugation and vacuum drying, which promotes the aggregation of exosomes at the microneedle tips, thereby enhancing delivery efficiency. Both the needle tips and backing were constructed using materials that exhibit excellent biocompatibility and water solubility. Trehalose and hyaluronic acid (HA) were incorporated as tip materials to provide protection for the exosomes, and polyvinylpyrrolidone (PVP) dissolved in absolute ethanol was chosen as the backing material. The morphology of the microneedle patch was characterized using microscopy and scanning electron microscope&#160;(SEM). The mechanical testing of the microneedle was assessed using a tensile meter to confirm their capability to penetrate the skin, and the release rate on pig skin was investigated to be 60 s. Furthermore, the morphology, size, and protein content of both fresh exosomes and exosomes in exo@MN were characterized using transmission electron microscope&#160;(TEM), nanoparticle tracking analysis (NTA), and western blotting (WB). The internalization of exosomes by dendritic cells (DCs) was characterized using confocal laser scanning microscope&#160;(CLSM), and the maturation of DCs was evaluated through flow cytometry. The morphological characterization and biological functions of the two types of exosomes are essentially consistent.

Autor destacado: Estrategias innovadoras basadas en microagujas para mejorar la administración y la estabilidad de los exosomas

Fabricación y caracterización de parches de microagujas para la carga y entrega de exosomas

My research focused on the efficient development of exosomes, the development of the microneedle strategy can increase exsome stability, enhance provide more possibility for the clinical application of exosomes. We will successfully develop the for advanced microneedle delivery systems. Those include self-healing porous microneedles for sustained drug delivery, ultrasound microneedle device for rapid loading and delivery of drugs, and cryomicroneedles for delivery of living cell, and sugar microneedles for delivery of exosomes.We use microneedle to pierce the biological barrier and then deliver exocells directly to the vector area efficiently. By storing them dry, we enhance their stability, making them precise, easy, and convenient for both clinical and home use. My lab, we focused on key technologies for developing the advanced microneedle-based delivery systems and that can load and deliver various therapeutics.Includes MRA, small molecular drug, antibodies, cell, and exosome. We are also investigate their chemical and physical properties and therapeutic efficacy in different biomedical applications.

Aquí, presentamos un protocolo para el aislamiento de exosomas, fabricación y caracterización de exo@MN parche. La Figura 1 ilustra el diagrama de flujo del proceso para la fabricación de exo@MN parche. Los exosomas se mezclaron con trehalosa y HA, y luego la mezcla se agregó al molde de microagujas y se centrifugó. Este proceso facilitó la agregación de exosomas en las puntas de las agujas, promoviendo una rápida liberación. Después del secado, se agregó una solución de PVP y s...

Los exosomas poseen un potencial clínico significativo, pero su aplicación práctica es limitada debido a la fácil eliminación in vivo y la poca estabilidad. Las microagujas presentan una solución al permitir la administración localizada mediante la perforación de barreras fisiológicas y la conservación en estado seco, abordando así las limitaciones de la administración de exosomas y ampliando su utilidad clínica.

Exosomes, as emerging &#34;next-generation&#34; biotherapeutics and drug delivery vectors, hold immense potential in diverse biomedical fields, ranging ...

fabrication-characterization-microneedle-patches-for-loading-delivery

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Fabrication and Characterization of Microneedle Patches for Loading and Delivery of Exosomes

852 vistas.  Tianjin University. Mi investigación se centró en el desarrollo eficiente de exosomas, el desarrollo de la estrategia de microagujas puede aumentar la estabilidad del exosoma, mejorar y proporcionar más posibilidades para la aplicación clínica de exosomas. Desarrollaremos con éxito los sistemas avanzados de administración de microagujas. Entre ellas se encuentran las microagujas porosas autorreparables para la administración sostenida de fármacos, el dispositivo de micr...

Video: Autor destacado: Estrategias innovadoras basadas en microagujas para mejorar la administración y la estabilidad de los exosomas

Exosomes, as emerging &#34;next-generation&#34; biotherapeutics and drug delivery vectors, hold immense potential in diverse biomedical fields, ranging from drug delivery and regenerative medicine to disease diagnosis and tumor immunotherapy. However, the rapid clearance by traditional bolus injection and poor stability of exosomes restrict their clinical application. Microneedles serve as a solution that prolongs the residence time of exosomes at the administration site, thereby maintaining the drug concentration and facilitating sustained therapeutic effects. In addition, microneedles also possess the ability to maintain the stability of bioactive substances. Therefore, we introduce a microneedle patch for loading and delivering exosomes and share the methods, including isolation of exosomes, fabrication, and characterization of exosome-loaded microneedle patches. The microneedle patches were fabricated using trehalose and hyaluronic acid as the tip materials and polyvinylpyrrolidone as the backing material through a two-step casting method. The microneedles demonstrated robust mechanical strength, with tips able to withstand 2 N. Pig skin was used to simulate human skin, and the tips of microneedles completely melted within 60 s after skin puncture. The exosomes released from the microneedles exhibited morphology, particle size, marker proteins, and biological functions comparable to those of fresh exosomes, enabling dendritic cells uptake and promoting their maturation.

Exosomes possess significant clinical potential, but their practical application is limited due to easy in vivo clearance and poor stability. Microneedles present a solution by enabling localized delivery by puncturing physiological barriers and dry-state preservation, thereby addressing the limitations of exosome administration and expanding their clinical utility.

Investigación

Bioingeniería

Isolation of Exosomes from Mouse Ovarian Epithelial Cancer Cells for Generating Microneedle Patch

To begin, take cultured mouse ovarian epithelial cancer cells. Remove the culture medium from the Petri dishes and wash twice with DPBS. Add 20 milliliters of Dulbecco's Modified Eagle Medium without FBS and penicillin-streptomycin solution.Incubate at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide for 48 hours. Then collect the cell culture supernatant from 20 Petri dishes of 15-centimeter diameter. Centrifuge at 300 G for 10 minutes at four degrees Celsius and collect the supernatant.Centrifuge the supernatant at 2, 000 G for 10 minutes at four degrees Celsius, and collect the supernatant to remove cellular debris. Now turn on the vacuum pump and connect it to the air inlet of the vacuum filtration system. Filter the supernatant through the 0.22-micron polyethersulfone membrane to remove vesicles or impurities larger than 0.22 microns.Add 15 milliliters of the filtered supernatant to the inner tube of the 100-kilodalton ultrafiltration tube. Centrifuge at 3, 500 G for 10 minutes at four degrees Celsius. Then remove the liquid from the outer tube.Next, collect the liquid from the inner tube. Add one milliliter of DPBS to the inner tube. Pipette repeatedly to resuspend exosomes, and then collect them.Centrifuge the liquid at 10, 000 G for 60 minutes at four degrees Celsius. Transfer the supernatant to a six-milliliter quick-snap centrifuge tube and seal it with a heat sealer. Cut open the tube after ultracentrifuging the supernatant for two hours.Once the supernatant is removed, resuspend the pellet in 100 microliters of DPBS to obtain the exosome solution.

Aislamiento de exosomas de células de cáncer epitelial de ovario de ratón para generar un parche de microagujas

Fabrication of Microneedle Using Exosomes Isolated from Mouse Ovarian Epithelial Cancer Cells

To begin, mix components A and B of polydimethylsiloxane, or PDMS, in a ratio of 10 to one. After stirring the mixture well, pour the mixture into a master mold. Place the PDMS mold under a pressure of one pound per square inch for 15 minutes to remove air bubbles.Cure the PDMS mold at 60 degrees Celsius for two hours. De-mold to obtain the production mold of the microneedle. Then, clean the production mold with ultra pure water before use.Quantify the protein content of the prepared exosome solution using a BCA assay kit. Add an appropriate amount of DPBS to the exosome solution. Now, prepare a solution of 200 milligrams per milliliter of trehalose using DPBS as the solvent.Stir for 20 minutes to ensure full dissolution. Next, prepare a solution of hyaluronic acid and polyvinylpyrrolidone, or PVP, using DPBS and ethanol as the solvent, respectively. Stir overnight to ensure full dissolution.Mix the exosome solution and trehalose solution in an equal ratio. Add an equal volume of hyaluronic acid solution and mix thoroughly to obtain the tip solution. Using a plasma cleaner, process the surface of the PDMS mold for 30 seconds at a low grade to enhance its hydrophilicity.Add 40 microliters of the tip solution to the PDMS mold. Centrifuge at 3, 000G for three minutes at room temperature to ensure the liquid fills the needle layer of the mold. Remove excess liquid from the mold and dry at room temperature in a vacuum drying oven for one day.Then, add 200 microliters of PVP solution to the PDMS mold. Centrifuge at 3, 000G for three minutes at room temperature to ensure the liquid fills the mold's backing layer. After drying the mold for one day, de-mold to obtain the exosome-loaded microneedle's patch.

Fabricación de microagujas utilizando exosomas aislados de células de cáncer epitelial de ovario de ratón

Morphological and Mechanical Characterization of Exosome Loaded Microneedle Patches

To begin, prepare the exosome loaded microneedle patch and paste its backing onto a 45-degree inclined surface. Position the patch under a stereo microscope. Turn on the illuminator and capture the morphology of the patch using a four times objective lens.For mechanical testing, cut out a three-by-three array from the patch and place it with the tips facing upwards on the rigid platform of a tensile meter. Adjust the height of the probe to bring it close to the needle tips without touching them. Set the parameters to stop automatically when the pressure reaches 20 Newton.Compress the needle tips vertically at a 0.5 millimeter per minute speed before recording the load versus displacement profile. The tips in the exosome loaded microneedle patch exhibited a conical shape arranged in a 10-by-10 array with sharp and intact needle tips. The tip of the microneedle can withstand the force of two Newtons, allowing it to penetrate through the skin barrier.