A F.L.Q. agradece o apoio apoiado pelo Programa Pioneiro de P&D de Zhejiang (2022C03031), o Programa Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento da China (2021YFA0910103), a Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (22274141, 22074080), a Fundação de Ciências Naturais da Província de Shandong (ZR2022ZD28) e o Programa Acadêmico Taishan da Província de Shandong (tsqn201909106). H.C. agradece o apoio financeiro da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82202329). Os autores reconhecem o uso de instrumentos no Shared Instrumentation Core Facility no Hangzhou Institute of Medicine (HIM), Academia Chinesa de Ciências.

Este estudo não requer autorização ética, uma vez que a pele de suíno utilizada para as experiências descritas na secção 3 foi adquirida como orelhas de porco comestíveis no mercado e não proveniente de animais experimentais.
1. Isolamento de exossomos
<ol><li>Cultura de células<ol><li>Cultive células de câncer epitelial de ovário de camundongo ID8 no meio de cultura Modified Eagle Medium (DMEM) de Dulbecco contendo 10% de soro fetal bovino e 1% de solução de penicilina-estreptomicina (100×) (ver Tabela de Materiais) em placas de Petri com diâmetro de 15 cm.</li>
		<li>Incubar células ID8 em uma incubadora de CO2 (ver Tabela de Materiais) a 37 ° C e 5% de CO2 até que a densidade celular atinja 90%.</li>
	</ol></li>
	<li>Isolamento de exossomos<ol><li>Remova o meio de cultura das placas de Petri e lave duas vezes com solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS). Adicione 20 mL de DMEM sem soro fetal bovino (ver Tabela de Materiais) e solução de penicilina-estreptomicina (ver Tabela de Materiais). Continuar a incubação a 37 °C e 5% de CO2 durante 48 h.</li>
		<li>Colher o sobrenadante da cultura celular de 20 placas de Petri de 15 cm de diâmetro. Centrifugar a 300 x g durante 10 min a 4 °C e recolher o sobrenadante para remoção das células livres.</li>
		<li>Centrifugar a 2000 x g durante 10 min 4 °C e recolher o sobrenadante para remover os detritos celulares.</li>
		<li>Conecte o sistema de filtragem a vácuo descartável de 0.22 μm (consulte a Tabela de Materiais) à bomba de vácuo de água circulante (consulte a Tabela de Materiais). Crie um vácuo para permitir que o sobrenadante passe pela membrana de poliéter sulfona de 0,22 μm e entre na câmara inferior do sistema de filtração, removendo efetivamente vesículas ou impurezas maiores que 0,22 μm do sobrenadante.<ol><li>Para conectar a bomba de vácuo, ligue o interruptor da bomba e, em seguida, conecte-o à entrada de ar do sistema de filtragem a vácuo. Ao fechar, desconecte primeiro a conexão com a bomba e depois desligue a bomba de vácuo. Este procedimento ajuda a evitar o refluxo da bomba de vácuo e a contaminação do fluido de cultura.</li>
		</ol></li>
		<li>Adicione 15 mL de sobrenadante ao tubo interno do tubo de ultrafiltração de 100 kDa (consulte a Tabela de Materiais). Centrifugue a 3500 x g por 10 min a 4 °C e remova o líquido do tubo externo. NOTA: Retenha partículas maiores que 100 kDa na membrana do tubo interno, enquanto proteínas menores que 100 kDa serão centrifugadas no tubo externo junto com a solução. Os exossomos eram maiores que 100 kDa e estavam agregados na membrana do tubo interno.</li>
		<li>Repita as etapas acima até que o volume total do líquido esteja dentro de 5 mL. Colete o líquido do tubo interno e adicione 1 mL de DPBS. Use uma pipeta para pipetar repetidamente no tubo interno, garantindo a ressuspensão dos exossomos anexados na DPBS e, em seguida, colete-os.</li>
		<li>Centrifugue a 10000 x g durante 60 min a 4 °C e transfira o sobrenadante para um tubo de centrifugação rápida de 6 ml (ver Tabela de Materiais). Sele o tubo com um selador térmico.</li>
		<li>Centrifugue a 100.000 x g por 2 h 4 °C usando uma ultracentrífuga (ver Tabela de Materiais). Abra o tubo de centrífuga de encaixe rápido, remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 100 μL de DPBS. Esta é a solução do exossomo. NOTA: Durante o processo de ressuspensão do pellet, é necessário pipetar e agitar a parede do tubo pelo menos 200 vezes usando uma pipeta.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Fabricação de exo@MN
<ol><li>Preparação do molde mestre<ol><li>Construa um modelo de microagulha com uma matriz de 10 x 10 usando software CAD, apresentando pontas cônicas com os seguintes parâmetros: uma altura de 1200 μm, um diâmetro de base de 400 μm e um passo (distância entre microagulhas adjacentes) de 900 μm.</li>
		<li>Use resina HTL como material e imprima o molde mestre da microagulha usando uma impressora 3D (consulte a Tabela de Materiais).</li>
		<li>Mergulhe o molde mestre em etanol absoluto por 1 h para remover qualquer resina aderida à superfície.</li>
		<li>Exponha o molde à luz ultravioleta por 5 min para curá-lo.</li>
		<li>Mergulhar novamente o molde em etanol absoluto durante 1 h, seguido de secagem a 60 °C em estufa de secagem durante 1 h. O molde mestre está pronto.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação do molde de produção<ol><li>Misture os componentes A e B do polidimetilsiloxano (PDMS, consulte a Tabela de Materiais) na proporção de 10:1. Mexa bem e despeje a mistura em um molde mestre.</li>
		<li>Coloque o molde PDMS sob uma pressão de 1 psi por 15 min para remover as bolhas de ar da mistura PDMS.</li>
		<li>Catalise o molde PDMS a 60 °C durante 2 h e depois desmolde para obter o molde de produção da microagulha.</li>
		<li>Limpe o molde de produção com água ultrapura antes de usar.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação da solução<ol><li>Quantificar o teor proteico da solução de exossomas utilizando um kit de ensaio BCA (ver Tabela de Materiais). Adicione uma quantidade adequada de DPBS para atingir uma concentração de 10 μg/μL para a solução de exossomo.</li>
		<li>Preparar uma solução de trealose a 200 mg/ml (ver Tabela de Materiais) utilizando a DPBS como solvente. Mexa por 20 min para garantir a dissolução completa.</li>
		<li>Prepare uma solução de ácido hialurônico (HA) a 200 mg / mL, consulte a Tabela de Materiais) usando DPBS como solvente. Mexa durante a noite para garantir a dissolução total.</li>
		<li>Preparar uma solução de 150 mg/ml de polivinilpirrolidona (PVP, ver Tabela de Materiais) utilizando etanol absoluto como solvente. Mexa durante a noite para garantir a dissolução total.</li>
		<li>Misture a solução de exossomo (10 μg/μL) e a solução de trealose (200 mg/mL) em uma proporção de volume de 1:1. Em seguida, adicione um volume igual de solução de AH (200 mg/mL). Misture bem para obter a solução de ponta.</li>
	</ol></li>
	<li>Fabricação de exo@MN<ol><li>Processe a superfície do molde PDMS usando um limpador de plasma (consulte a Tabela de Materiais) por 30 s em um grau baixo para aumentar sua hidrofilicidade.</li>
		<li>Adicione 40 μL da solução da ponta ao molde PDMS. Centrifugue à temperatura ambiente (RT) e 3000 x g por 3 min para garantir que o líquido preencha a camada de agulha do molde.</li>
		<li>Remova o excesso de líquido no molde e seque em RT em um forno de secagem a vácuo (consulte a Tabela de Materiais) por 1 dia.</li>
		<li>Adicione 200 μL de solução PVP ao molde PDMS. Centrifugue 3000 x g por 3 min em RT para garantir que o líquido preencha a camada de suporte do molde.</li>
		<li>Seque o molde em RT em um forno de secagem por 1 dia e, em seguida, desmolde para obter o adesivo exo@MN. NOTA: Mantenha o adesivo exo@MN armazenado em um forno de secagem até que esteja pronto para uso.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67109/67109fig01.jpg"> Figura 1: Processo de fabricação de patches exo@MN. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67109/67109fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
3. Caracterização de manchas exo@MN
<ol><li>Observação da morfologia<ol><li>Cole o suporte do adesivo em uma superfície inclinada de 45° e posicione-o sob um microscópio estéreo (consulte a Tabela de Materiais).</li>
		<li>Ligue o iluminador e capture a morfologia do adesivo usando uma objetiva 4x.</li>
	</ol></li>
	<li>Microscopia eletrônica de varredura (MEV)<ol><li>Prenda o adesivo ao sample stage usando adesivo condutor e trate-o com um revestidor fino automático (consulte a Tabela de Materiais) por 30 s.</li>
		<li>Capture imagens do patch exo@MN usando SEM (consulte a Tabela de Materiais) com uma tensão de aceleração de 1 kV.</li>
	</ol></li>
	<li>Testes mecânicos<ol><li>Corte uma matriz 3 x 3 do remendo e coloque-a com as pontas voltadas para cima na plataforma rígida de um medidor de tração (consulte a Tabela de Materiais). Ajuste a altura da sonda para aproximá-la das pontas da agulha sem tocá-las.</li>
		<li>Defina os parâmetros para parar quando a pressão atingir 20 N automaticamente. Comprima as pontas da agulha verticalmente a uma velocidade de 0,5 mm/min e registre a carga versus o perfil de deslocamento.</li>
	</ol></li>
	<li>Dissolução<ol><li>Compre orelhas de porco frescas no mercado e corte-as em pedaços (5 cm x 5 cm x 0,3 cm). Espalhe a pele de porco sobre uma mesa e use papel para secar a umidade da superfície.</li>
		<li>Prepare quatro adesivos de microagulhas secos com as pontas das agulhas voltadas para baixo na pele do porco, espaçando cada adesivo ligeiramente. Usando o polegar e o indicador, pressione verticalmente cada adesivo de microagulha. Remova um adesivo a cada 15 s.</li>
		<li>Coloque imediatamente o adesivo removido em um forno de secagem e seque por 5 min. Corte uma coluna de pontas de microagulhas, coloque-as horizontalmente sob um microscópio (consulte a Tabela de Materiais) e use uma lente objetiva 4x para observar a dissolução das pontas.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Caracterização de exossomos em exo@MN patch
NOTA: As pontas das microagulhas de exo@MN são dissolvidas em 100 μL de solução de DPBS para realizar a seguinte caracterização nos exossomos liberados.
<ol><li>Microscopia eletrônica de transmissão (MET)<ol><li>Trate a malha de cobre (ver Tabela de Materiais) com um tratamento hidrofílico usando um limpador de íons (ver Tabela de Materiais) por 5 min.</li>
		<li>Dispense 10 μL da amostra no lado de carbono da malha de cobre. Deixe repousar por 1 min e, em seguida, remova o líquido enxugando-o com papel de filtro pelas bordas.</li>
		<li>Adicione 10 μL de acetato de uranilo a 3% (consulte a Tabela de Materiais) à amostra. Deixe repousar por 10 s e, em seguida, remova o líquido enxugando com papel de filtro das bordas.</li>
		<li>Adicione 10 μL de acetato de uranilo a 3% à amostra. Deixe repousar por 1 min, depois remova o líquido enxugando-o com papel de filtro das bordas e seque ao ar em RT.</li>
		<li>Capture imagens dos exossomos usando MET (consulte a Tabela de Materiais) com uma tensão de aceleração de 80 kV.</li>
	</ol></li>
	<li>Análise de rastreamento de nanopartículas (NTA)<ol><li>Diluir a solução de exossomo com DPBS para atingir uma concentração de partículas de 1 x 107 partículas/ml. Injete lentamente 1 ml da solução de exossoma na câmara de recolha da NTA utilizando uma seringa de 1 ml (ver Tabela de Materiais).</li>
		<li>Defina o tipo de procedimento operacional padrão (SOP) do instrumento para EV-488 para detectar a distribuição de tamanho dos exossomos.</li>
	</ol></li>
	<li>Western blotting (WB)<ol><li>Prepare o tampão de lise misturando o tampão de lise do ensaio de radioimunoprecipitação (RIPA): fluoreto de fenilmetanossulfonilo (ver Tabela de Materiais) na proporção de 100:1. Lise os exossomos no gelo por 20 min, fazendo vórtice a cada 10 min.</li>
		<li>Centrifugar a solução a 12.000 x g durante 10 min a 4 °C. Colete o sobrenadante para medir a concentração de proteínas.</li>
		<li>Adicione 5x tampão de carregamento SDS-PAGE (consulte a Tabela de Materiais) ao sobrenadante em uma proporção de volume de 1: 4 e misture bem. Aqueça a 100 °C por 10 min para desnaturar as proteínas.</li>
		<li>Adicione 5 μL de um marcador de proteína pré-corado de 180 kDa (consulte a Tabela de Materiais) e 10 μg de amostra desnaturada a um gel pré-moldado a 4% -20% (consulte a Tabela de Materiais). Execute o sistema de eletroforese (consulte a Tabela de Materiais) a 60 V por 10 min e depois a 140 V por 50 min.</li>
		<li>Transfira as proteínas do gel para uma membrana de PVDF (ver Tabela de Materiais) pré-ativada com metanol. Execute o sistema de eletroforese a 290 mA por 90 min em gelo.</li>
		<li>Incube a membrana de PVDF em solução de leite desnatado a 5% por 1 h. Lave três vezes com solução salina tamponada com tris com tween (TBST, consulte a Tabela de Materiais) por 5 min cada.</li>
		<li>Corte as faixas-alvo com base na posição da proteína. Incubar as bandas com anticorpo CD63 anti-rato e anticorpo Alix anti-rato (ver Tabela de Materiais) diluídas até à concentração apropriada de acordo com as instruções do fabricante e incubar durante a noite a 4 °C.</li>
		<li>Lave as pulseiras três vezes com TBST. Incubar com IgG anti-coelho conjugada com HRP (ver Tabela de Materiais) em RT por 1 h. Em seguida, lave três vezes com TBST novamente.</li>
		<li>Aplique um reagente de detecção super ECL (consulte a Tabela de Materiais) para cobrir a superfície das bandas e exponha e capture imediatamente as bandas usando um gerador de imagens de gel (consulte a Tabela de Materiais).</li>
	</ol></li>
	<li>Microscopia confocal de varredura a laser (CLSM)<ol><li>Cultive 5 x 105 DCs em um prato confocal usando 2 mL de meio Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) (consulte a Tabela de Materiais). Adicionar exossomas ou exo@MN e incubar a 37 °C durante 24 h.</li>
		<li>Adicione uma gota de Hoechst 33342 a cada placa confocal e incube no escuro a 37 °C durante 20 min.</li>
		<li>Realize imagens com um CLSM (consulte a Tabela de Materiais) usando uma lente objetiva de 60x. Aplique uma gota de óleo de imersão (consulte a Tabela de Materiais) na lente e coloque o prato confocal no palco. Ajuste os eixos x/y/z para localizar o plano focal apropriado das células.</li>
		<li>Inicie a imagem com canais DAPI/TRITC/TD, selecione uma resolução de 1024 px e defina o modo rápido para 1/8 s.</li>
	</ol></li>
	<li>Citometria de fluxo<ol><li>Cultive DCs em uma placa de 6 poços, cada poço contendo 5 x 105 células e 2 mL de meio 1640. Adicionar volumes iguais de solução de DPBS, exossomas, microagulhas sem exossomas e exo@MN, respetivamente, e incubar a 37 °C durante 24 h.</li>
		<li>Transfira o meio de cada poço para tubos centrífugos. Centrifugue a 300 x g durante 3 min a 4 °C e retire o sobrenadante.</li>
		<li>Adicione 0,5 μL de anticorpo FITC-CD11c, 2,5 μL de anticorpo APC-CD80 e 0,5 μL de anticorpo Pacific Blue I-A/I-E (consulte a Tabela de Materiais) a 100 μL de solução BSA a 5% (consulte a Tabela de Materiais). Misture bem, ressuspenda as células e incube em uma coqueteleira no gelo e no escuro por 20 min.</li>
		<li>Adicione 1 mL de DPBS e centrifugue a 300 x g por 3 min a 4 ° C e, em seguida, remova o sobrenadante. Repita a lavagem duas vezes para remover os anticorpos não ligados e, em seguida, prossiga para analisar os canais fluorescentes correspondentes por citometria de fluxo (consulte a Tabela de Materiais).<ol><li>Primeiro, no gráfico de dispersão FSC-A/SSC-A, coloque a população de células principal como P1. No gráfico de dispersão SSC-A/SSC-H da população de células P1, faça o gate de uma região quadrada P2 ao longo da diagonal para remover as células agregadas.</li>
			<li>Realize a análise de fluorescência na população de células P2 usando os canais FITC, APC e Pacific Blue. Defina a condição de parada para coletar 10.000 células na porta P2.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>5. Análise estatística
<ol><li>Expresse dados quantitativos como médias ± desvios padrão (DP). Avalie a significância estatística usando a análise do teste t usando um aplicativo de software de análise de dados apropriado. Considere valores de p menores que 0,05 para indicar significância estatística. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001.</li>
</ol>

Adesivos de microagulhas para entrega sustentada de exossomos em aplicações biomédicas

<ol>
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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microneedle-mediated+vaccine+delivery+to+the+oral+mucosa.">Microneedle-mediated vaccine delivery to the oral mucosa.</a> Adv Healthc Mater. 8 (4), 1801180 (2019).</li><li>Hu, S., Zhu, D., Li, Z., Cheng, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detachable+microneedle+patches+deliver+mesenchymal+stromal+cell+factor-loaded+nanoparticles+for+cardiac+repair.">Detachable microneedle patches deliver mesenchymal stromal cell factor-loaded nanoparticles for cardiac repair.</a> ACS Nano. 16 (10), 15935-15945 (2022).</li><li>Yang, W., Zheng, H., Lv, W., Zhu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+status+and+prospect+of+immunotherapy+for+colorectal+cancer.">Current status and prospect of immunotherapy for colorectal cancer.</a> Int J Colorectal Dis. 38 (1), 266-276 (2023).</li><li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+and+technologies+for+exosome+isolation+and+characterization.">Methods and technologies for exosome isolation and characterization.</a> Small Methods. 2 (9), 1800021 (2018).</li><li>Bosch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trehalose+prevents+aggregation+of+exosomes+and+cryodamage.">Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage.</a> Sci Rep. 6, 36162 (2016).</li><li>Bhattacharyya, M., Jariyal, H., Srivastava, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronic+acid:+More+than+a+carrier,+having+an+overpowering+extracellular+and+intracellular+impact+on+cancer.">Hyaluronic acid: More than a carrier, having an overpowering extracellular and intracellular impact on cancer.</a> Carbohydr Polym. 317, 121081 (2023).</li><li>Chang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryomicroneedles+for+transdermal+cell+delivery.">Cryomicroneedles for transdermal cell delivery.</a> Nat Biomed Eng. 5 (9), 1008-1018 (2021).</li></ol>

H. C., F.L.Q e S.J.M são inventores em um pedido de patente que foi depositado com base nos dados deste manuscrito. HC é o fundador científico da Medcraft Biotech. Inc.

Atualmente, os principais métodos de isolamento de exossomos incluem ultracentrifugação, centrifugação com gradiente de densidade, ultrafiltração, precipitação, esferas magnéticas de imunoafinidade e microfluídica24. Devido à capacidade de carga limitada das microagulhas causada por seu pequeno espaço na ponta da agulha, é necessário aumentar a concentração de exossomos para carregar mais. Portanto, escolhemos a ultrafiltração para concentrar o sobrenadante da cultura de célula...

Os exossomos, que são pequenas vesículas liberadas pelas células na matriz extracelular, têm sido propostos como potenciais vetores bioterapêuticos e de liberação de fármacos para o tratamento de diversas doenças e cânceres1. Durante seu processo de biogênese, os exossomos encapsulam várias moléculas biologicamente ativas de dentro das células, incluindo proteínas funcionais e ácidos nucléicos2. Como resultado, quando absorvidos pelas células receptoras durante o processo de transporte, os exossomos têm a capacidade de modular a expressão gênica e as funções celulares nas células-alvo3. Como uma espécie de mensageiro natural de informações, os exossomos foram totalmente aproveitados na regeneração de tecidos, regulação imunológica e como portador de entrega4. Por meio de técnicas de engenharia, ligantes específicos podem ser enriquecidos na superfície dos exossomos, permitindo a indução ou inibição de eventos de sinalização em células receptoras ou visando tipos específicosde células 5. Agentes quimioterápicos também podem ser carregados em exossomos para tratamento do câncer6. Além disso, os exossomos têm a capacidade de atravessar a barreira hematoencefálica para entrega de carga terapêutica, tornando-os altamente promissores para o tratamento de distúrbios cerebrais7. Em comparação com os lipossomas, os exossomos exibem maior captação celular e melhor biocompatibilidade8. Eles são capazes de entrar com eficiência em outras células, demonstrando melhor tolerância e menor toxicidade9. No entanto, a injeção tradicional de exossomos em bolus é propensa a sequestro e rápida depuração pelo fígado, rins e baço na corrente sanguínea10. Além disso, os exossomos têm baixa estabilidade in vitro e são suscetíveis a condições de armazenamento, o que restringe suas aplicações clínicas11.
As microagulhas, uma série de pontas de agulha de tamanho micrométrico, têm a capacidade de penetrar nas barreiras fisiológicas para a entrega de medicamentos de moléculas pequenas12, proteínas13, ácidos nucléicos14 e nanomedicamentos15. As microagulhas são projetadas com precisão para atingir lesões na superfície da pele, e suas pontas dispersas garantem a distribuição uniforme do medicamento no local alvo, ampliando assim seu impacto terapêutico16. O design e a composição do material das microagulhas facilitam o armazenamento seco de substâncias bioativas, como proteínas e ácidos nucléicos, aumentando sua estabilidade17. Os métodos tradicionais de injeção têm uma duração de ação relativamente curta e podem causar dor, induzindo medo nos pacientes18. O comprimento micrométrico da microagulha minimiza o trauma tecidual e evita a estimulação nervosa, eliminando a dor e melhorando a adesão do paciente19. Além disso, a natureza amigável das microagulhas permite que os pacientes autoadministrem o tratamento sem a necessidade de pessoal especializado16. Além da pele, as microagulhas também podem ser usadas em tecidos como olhos20, mucosa oral21, coração22 e vasos sanguíneos23. A aplicação de microagulhas para a entrega clínica de exossomos fornece uma estratégia promissora e prospectiva.
Portanto, introduzimos um adesivo de microagulha (exo@MN) carregado com exossomos e divulgamos seu método de fabricação. Os adesivos de microagulhas foram fabricados usando um método de fundição em duas etapas, juntamente com centrifugação e secagem a vácuo, que promove a agregação de exossomos nas pontas das microagulhas, aumentando assim a eficiência da entrega. Tanto as pontas das agulhas quanto o suporte foram construídos com materiais que apresentam excelente biocompatibilidade e solubilidade em água. A trealose e o ácido hialurônico (AH) foram incorporados como materiais de ponta para fornecer proteção aos exossomos, e a polivinilpirrolidona (PVP) dissolvida em etanol absoluto foi escolhida como material de suporte. A morfologia do adesivo de microagulha foi caracterizada por microscopia e microscópio eletrônico de varredura (MEV). O teste mecânico da microagulha foi avaliado usando um medidor de tração para confirmar sua capacidade de penetrar na pele, e a taxa de liberação na pele de porco foi investigada em 60 s. Além disso, a morfologia, o tamanho e o conteúdo proteico dos exossomos frescos e dos exossomos em exo@MN foram caracterizados usando microscópio eletrônico de transmissão (TEM), análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) e western blotting (WB). A internalização dos exossomos pelas células dendríticas (DCs) foi caracterizada por meio de microscópio confocal de varredura a laser (CLSM), e a maturação das DCs foi avaliada por citometria de fluxo. A caracterização morfológica e as funções biológicas dos dois tipos de exossomos são essencialmente consistentes.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100x penicillin-streptomycin solutions</td>
			<td>Jrunbio Scientific</td>
			<td>MA0110</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>180 kDa pre-stained protein marker</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>26616</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3% Uranyl acetate</td>
			<td>Henan Ruixin Experimental Supplies</td>
			<td>GZ02625</td>
			<td>Morphological characterization of exosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D printer</td>
			<td>BMF technology</td>
			<td>nanoArch S130</td>
			<td>Mold preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4%&#8211;20% precast gel</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>ExpressPlus PAGE GEL</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#215; SDS-PAGE loading buffer</td>
			<td>Titan</td>
			<td>04048254</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Alix antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>12422-1-AP</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD63 antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>ab217345</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD80 antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>104713</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Auto fine coater</td>
			<td>ZIZHU</td>
			<td>JBA5-100</td>
			<td>Morphological characterization of microneedle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA assay kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0012</td>
			<td>Protein concentration assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Muitifuge X1R pro</td>
			<td>Cell centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circulating water vacuum pump</td>
			<td>Yuhua Instrument</td>
			<td>SHZ-D(III)</td>
			<td>Filtration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>CellXpert C170</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>A1HD25</td>
			<td>Fluorescence imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper mesh</td>
			<td>Beijing Zhongjingkeyi Technology&#160;</td>
			<td>JF-ZJKY/300</td>
			<td>Morphological characterization of exosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D- (+) -Trehalose dihydrate</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>5138-23-4</td>
			<td>Fabrication of microneedle&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium</td>
			<td>Meilunbio</td>
			<td>MA0212</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s phosphate-buffered saline</td>
			<td>Meilunbio</td>
			<td>MA0010</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis system</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>PowerPac-basic</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Jrunbio Scientific</td>
			<td>JR100</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-mouse CD11c antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>117305</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometry</td>
			<td>BD</td>
			<td>LSR Fortessa</td>
			<td>Fluorescence detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imager</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>Amersham ImageQuant 800</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP-conjugated anti-rabbit IgG</td>
			<td>CST</td>
			<td>7074S</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HTL resin</td>
			<td>BMF technology</td>
			<td></td>
			<td>Mold preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronic acid (MW = 300 kDa)</td>
			<td>Bloomage Biotechnology</td>
			<td>9004-61-9</td>
			<td>Fabrication of microneedle&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion oil</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MXA22168</td>
			<td>Fluorescence imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion cleaner</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>EC-52000IC</td>
			<td>Morphological characterization of exosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX53</td>
			<td>Observe the microneedle tip dissolving process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse ovarian epithelial cancer cell ID8</td>
			<td>MeisenCTCC</td>
			<td>&#160;CC90105</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoparticle tracking analysis</td>
			<td>Particle Metrix</td>
			<td>ZetaView</td>
			<td>Size analysis of exosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue anti-mouse I-A/I-E antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>107619</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST507</td>
			<td>Protease inhibitors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Hefei Kejing Material Technology</td>
			<td>PDC-36G</td>
			<td>Fabrication of microneedle&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>9016-00-6</td>
			<td>Mold preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylpyrrolidone (MW = 40 kDa)</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>9003-39-8</td>
			<td>Fabrication of microneedle&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism&#160;</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>Version 9</td>
			<td>Statistical analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-snap centrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>344619</td>
			<td>Exosomes extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA lysis buffer</td>
			<td>Applygen</td>
			<td>C1053</td>
			<td>Lysis membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell park memorial institute 1640</td>
			<td>Meilunbio</td>
			<td>MA0548</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning electron microscope</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>JSM-IT800</td>
			<td>Morphological characterization of microneedle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX16</td>
			<td>Characterization of morphology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super ECL detection reagent</td>
			<td>Applygen</td>
			<td>P1030</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tensile meter</td>
			<td>Instron</td>
			<td>68SC-05</td>
			<td>Mechanical testing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscope</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>JEM-2100plus</td>
			<td>Morphological characterization of exosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris buffered saline</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>JF-A500027-0004</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST825</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>Optima XPN-100</td>
			<td>Exosomes extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrafiltration tube</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC910096</td>
			<td>Exosomes concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum drying oven</td>
			<td>Shanghai Yiheng Technology</td>
			<td>DZF-6024</td>
			<td>Fabrication of microneedle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum filtration system</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BS-500-XT</td>
			<td>Filtration</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication and characterization of microneedle patches for loading and delivery of exosomes

Os exossomos, como bioterapêuticos emergentes de "próxima geração" e vetores de entrega de medicamentos, possuem imenso potencial em diversos campos biomédicos, desde a administração de medicamentos e medicina regenerativa até o diagnóstico de doenças e imunoterapia tumoral. No entanto, a rápida depuração por injeção tradicional em bolus e a baixa estabilidade dos exossomos restringem sua aplicação clínica. As microagulhas servem como uma solução que prolonga o tempo de residência dos exossomos no local de administração, mantendo assim a concentração do medicamento e facilitando os efeitos terapêuticos sustentados. Além disso, as microagulhas também possuem a capacidade de manter a estabilidade de substâncias bioativas. Portanto, introduzimos um adesivo de microagulha para carregar e entregar exossomos e compartilhamos os métodos, incluindo isolamento de exossomos, fabricação e caracterização de adesivos de microagulhas carregados com exossomos. Os adesivos de microagulhas foram fabricados usando trealose e ácido hialurônico como materiais de ponta e polivinilpirrolidona como material de suporte por meio de um método de fundição em duas etapas. As microagulhas demonstraram resistência mecânica robusta, com pontas capazes de suportar 2 N. A pele de porco foi usada para simular a pele humana, e as pontas das microagulhas derreteram completamente dentro de 60 s após a punção da pele. Os exossomos liberados das microagulhas exibiram morfologia, tamanho de partícula, proteínas marcadoras e funções biológicas comparáveis às dos exossomos frescos, permitindo a captação de células dendríticas e promovendo sua maturação.

Exosomes, which are small vesicles released by cells into the extracellular matrix, have been proposed as potential biotherapeutics and drug delivery vectors for the treatment of several diseases and cancers1. During their biogenesis process, exosomes encapsulate various biologically active molecules from within the cells, including functional proteins and nucleic acids2. As a result, when taken up by recipient cells during the transport process, exosomes have the ability to modulate gene expression and cellular functions in the target cells3. As a kind of natural information messenger, exosomes have been fully taken advantage of in tissue regeneration, immune regulation, and as a delivery carrier4. Through engineering techniques, specific ligands can be enriched on the surface of exosomes, enabling the induction or inhibition of signaling events in recipient cells or targeting specific cell types5. Chemotherapeutic agents can also be loaded into exosomes for cancer treatment6. Moreover, exosomes have the ability to cross the blood-brain barrier for therapeutic cargo delivery, making them highly promising for the treatment of brain disorders7. Compared to liposomes, exosomes exhibit enhanced cellular uptake and improved biocompatibility8. They are capable of efficiently entering other cells while demonstrating better tolerance and lower toxicity9. However, the traditional bolus injection of exosomes is prone to sequestration and rapid clearance by the liver, kidneys, and spleen in the bloodstream10. Moreover, exosomes have poor stability in vitro and are susceptible to storage conditions, which restrict their clinical applications11.
Microneedles, an array of micrometric-sized needle tips, have the capability to penetrate physiological barriers for the delivery of small molecule drugs12, proteins13, nucleic acids14, and nanomedicines15. Microneedles are precisely engineered to target lesions on the skin surface, and their dispersed tips ensure uniform drug distribution at the targeted site, thus amplifying their therapeutic impact16. The design and material composition of microneedles facilitate&#160;the dry storage of bioactive substances such as proteins and nucleic acids, enhancing their stability17. Traditional injection methods have a relatively short duration of action and can cause pain, inducing fear in patients18. The micrometer-sized length of microneedle minimizes tissue trauma and prevents nerve stimulation, thereby eliminating pain and improving patient compliance19. Additionally, the user-friendly nature of microneedles allows patients to self-administer the treatment without the need for specialized personnel16. In addition to the skin, microneedles can also be used in tissues such as the eyes20, oral mucosa21, heart22, and blood vessels23. The application of microneedles for the clinical delivery of exosomes provides a promising and prospective strategy.
Hence, we introduce an exosome-loaded microneedle (exo@MN) patch and disclose its fabrication method. The microneedle patches were fabricated using a two-step casting method, along with centrifugation and vacuum drying, which promotes the aggregation of exosomes at the microneedle tips, thereby enhancing delivery efficiency. Both the needle tips and backing were constructed using materials that exhibit excellent biocompatibility and water solubility. Trehalose and hyaluronic acid (HA) were incorporated as tip materials to provide protection for the exosomes, and polyvinylpyrrolidone (PVP) dissolved in absolute ethanol was chosen as the backing material. The morphology of the microneedle patch was characterized using microscopy and scanning electron microscope&#160;(SEM). The mechanical testing of the microneedle was assessed using a tensile meter to confirm their capability to penetrate the skin, and the release rate on pig skin was investigated to be 60 s. Furthermore, the morphology, size, and protein content of both fresh exosomes and exosomes in exo@MN were characterized using transmission electron microscope&#160;(TEM), nanoparticle tracking analysis (NTA), and western blotting (WB). The internalization of exosomes by dendritic cells (DCs) was characterized using confocal laser scanning microscope&#160;(CLSM), and the maturation of DCs was evaluated through flow cytometry. The morphological characterization and biological functions of the two types of exosomes are essentially consistent.

Autor em destaque: Estratégias inovadoras baseadas em microagulhas para entrega e estabilidade aprimoradas de exossomos

Fabricação e caracterização de adesivos de microagulhas para carregamento e entrega de exossomos

My research focused on the efficient development of exosomes, the development of the microneedle strategy can increase exsome stability, enhance provide more possibility for the clinical application of exosomes. We will successfully develop the for advanced microneedle delivery systems. Those include self-healing porous microneedles for sustained drug delivery, ultrasound microneedle device for rapid loading and delivery of drugs, and cryomicroneedles for delivery of living cell, and sugar microneedles for delivery of exosomes.We use microneedle to pierce the biological barrier and then deliver exocells directly to the vector area efficiently. By storing them dry, we enhance their stability, making them precise, easy, and convenient for both clinical and home use. My lab, we focused on key technologies for developing the advanced microneedle-based delivery systems and that can load and deliver various therapeutics.Includes MRA, small molecular drug, antibodies, cell, and exosome. We are also investigate their chemical and physical properties and therapeutic efficacy in different biomedical applications.

Aqui, apresentamos um protocolo para o isolamento de exossomos, fabricação e caracterização de exo@MN patch. A Figura 1 ilustra o fluxograma do processo para a fabricação de exo@MN patch. Os exossomos foram misturados com trealose e AH, e a mistura foi então adicionada ao molde de microagulhas e centrifugada. Esse processo facilitou a agregação de exossomos nas pontas das agulhas, promovendo liberação rápida. Após a secagem, a solução de PVP foi adicionada e centrifugada para ...

Os exossomos possuem potencial clínico significativo, mas sua aplicação prática é limitada devido à fácil depuração in vivo e baixa estabilidade. As microagulhas apresentam uma solução ao permitir a entrega localizada, perfurando barreiras fisiológicas e preservação do estado seco, abordando assim as limitações da administração de exossomos e expandindo sua utilidade clínica.

Exosomes, as emerging &#34;next-generation&#34; biotherapeutics and drug delivery vectors, hold immense potential in diverse biomedical fields, ranging ...

fabrication-characterization-microneedle-patches-for-loading-delivery

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Fabrication and Characterization of Microneedle Patches for Loading and Delivery of Exosomes

803 visualizações.  Tianjin University. Minha pesquisa se concentrou no desenvolvimento eficiente de exossomos, o desenvolvimento da estratégia de microagulhas pode aumentar a estabilidade do exossomo, aumentar a possibilidade de aplicação clínica de exossomos. Desenvolveremos com sucesso o para sistemas avançados de entrega de microagulhas. Isso inclui microagulhas porosas autocurativas para entrega sustentada de medicamentos, dispositivo de microagulha de ultrassom para carregamento e entreg...