Este estudio introdujo una manipulación quirúrgica para exponer el DRG torácico en ratones anestesiados para la obtención de imágenes de calcio in vivo junto con el registro sincronizado del electrocardiograma. De este modo, intentamos responder si la acupuntura en el PC6 en el foramen podría activar la neurona DRG y regular simultáneamente el electrocardiograma. Las técnicas que se utilizan actualmente en los estudios de acupuntura incluyen la electrofisiología in vivo o vitro, el rastreo neuronal y diversas estrategias combinadas con la optogenética y la quimiogenética.
Las imágenes de calcio in vivo introducidas en este estudio ayudan a comprender mejor las actividades de las poblaciones de neuronas DRG inducidas por la acupuntura, todas en diferentes modelos animales, a través de registros dinámicos y en tiempo real. Debido a la curvatura fisiológica de la columna torácica en uno a cinco segmentos vertebrales torácicos, los GRD torácicos son bastante difíciles de exponer. Además, las influencias de los ritmos cardíacos y pulmonares hacen que la fijación de los GRD torácicos sea un desafío.
De lo contrario, la anestesia respiratoria y el mantenimiento de la condición de los ratones durante horas no son fáciles. Las imágenes de calcio in vivo revelan la actividad de poblaciones de neuronas específicas mediante el uso de ratones de ingeniería genética. Esta es la primera vez que se observan in vivo las neuronas DRG torácicas.
Este enfoque realiza la observación de las actividades neuronales producidas por estimulaciones somáticas o viscerales, así como su diafonía. Nuestro laboratorio ha establecido métodos para la obtención de imágenes de calcio in vivo de DRG torácica y lumbar, y en el futuro, revisaremos los receptores relacionados con los factores iniciadores de la acupuntura, la hipersensibilidad de los puntos de acupuntura, las interacciones entre la estimulación de la acupuntura somática y las entradas viscerales. Después de realizar una traqueotomía en un ratón anestesiado, coloque el ratón en posición prona sobre una almohadilla térmica.
Realice una incisión longitudinal de dos centímetros en el centro de la nuca, que se extienda desde las seis vértebras cervicales hasta las tres vértebras torácicas. Separe cuidadosamente las glándulas de grasa e hibernación en la cara anterior de las vértebras torácicas del ratón, evitando los vasos sanguíneos debajo de las glándulas. Use tijeras de resorte para cortar la piel y las capas musculares, incluido el músculo trapecio.
Inserte un retractor entre los músculos para ayudar con una mayor exposición. Retire los músculos que se unen a la pinza de la cabeza y la parte recta de los músculos largos del cuello, exponiendo los procesos espinosos de los dos torácicos. Desplazar los músculos semiespinal y espinal para exponer el arco vertebral de C6 a T3. Cortar la conexión entre la placa del arco vertebral y la apófisis articular del torácico.
Utilice pinzas finas para extirpar meticulosamente las apófisis articulares izquierda y derecha y las apófisis mamilares de la torácica. Despeja el tejido conectivo suprayacente. Exponga cuidadosamente el ganglio de una raíz dorsal torácica izquierda o derecha, o DRG, asegurando la integridad del epineuro en el lado elegido.
Coloque una pequeña bola de algodón empapada en solución salina tibia sobre el DRG expuesto para mantener la humedad. Conecte el monitor de ECG con el polo negativo en la extremidad superior derecha, el cable de tierra en la extremidad inferior derecha y el polo positivo en la extremidad inferior izquierda. Coloque el mouse en el escenario de la pinza espinal personalizada con una almohadilla térmica.
Asegure el ratón con dos clips unidos a las apófisis articulares de las seis cervicales y las tres torácicas. Coloque la pinza espinal con el ratón asegurado bajo el microscopio confocal. Coloque el objetivo de aire de larga distancia de trabajo 10x/0.32 sobre el 1 DRG torácico expuesto.
Establezca el tamaño del paso en 25 micrómetros y una resolución de 512 por 512 o 1.024 por 1.024 píxeles. Ajuste el eje z de la etapa hacia arriba y hacia abajo y capture todo el DRG torácico 1. Aplique la estimulación con pincel en la extremidad superior del ratón y evalúe la capacidad de respuesta de las neuronas DRG de las que se obtuvieron imágenes.
Realizar estimulaciones de los nervios periféricos en la estimulación PC6 utilizando un estimulador. En condiciones basales, la mayoría de las neuronas en el DRG torácico 1 no mostraron fluorescencia GFP. La estimulación somática dio lugar a un aumento rápido y transitorio de la fluorescencia de GCaMP con un aumento en el número y la intensidad de GFP.
Las estimulaciones de los nervios periféricos en la aplicación de PC6 dieron lugar a cambios similares en la fluorescencia de GCaMP que la estimulación somática. Las neuronas se marcaron y numeraron dentro de un solo DRG torácico 1 después del rastreo con software de imágenes. Las neuronas que mostraban cambios en la intensidad de la fluorescencia superiores al 130% del umbral F0 se consideraron respuestas positivas.
El histograma mostró los diferentes diámetros de las neuronas que responden a las estimulaciones de los nervios periféricos en PC6. Las estimulaciones de los nervios periféricos a la estimulación PC6 mostraron un aumento de la frecuencia cardíaca.
