Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre el papel directo del tau en el compartimento nuclear, excluyendo cualquier posible contaminación citoplasmático de tau. La principal ventaja de esta técnica es que es ampliamente aplicable al estudio sobre la función nuclear de tau en otros tipos de células y en diferentes condiciones celulares. Demostrando el procedimiento estará Giacomo Siano, un post-doc de mi laboratorio.
Comience por envolpar cuatro veces 10 a las cinco células de la línea celular de neuroblastoma humano SH-SY5Y para ser transfectadas con el vector de control vacío, cuatro veces 10 a las cinco células para ser transfectadas con tau sin etiquetar, cuatro veces 10 a las cinco células que se trans infectan con tau-NLS. Al día siguiente del chapado, incuba por separado 400 nanogramos de ADN y el volumen adecuado de lípidos catiónicos en un tubo de 250 microlitros de suero reducido por pozo. Después de cinco minutos a temperatura ambiente, combine cada vector con un volumen de lípidos catiónicos e incubar los complejos lipídicos del ADN durante 20 minutos a temperatura ambiente.
Al final de la incubación, sustituya los sobrenadantes de cada pozo por dos mililitros de medio de cultivo completo fresco y transfecten cada pocó cada pocidio con la solución adecuada del complejo de lípidos de ADN para una incubación nocturna a 37 grados centígrados. Al día siguiente, sustituya los sobrenadantes por un medio de diferenciación fresco. Para el análisis de Western Blot, lave las células trans infectadas y diferenciadas en cada pozo con PBS e incubar las células con 500 microlitros de 0.1%Trypsin por pozo durante cuatro minutos a 37 grados Celsius.
Cuando las células se hayan desprendido, detenga la reacción con un volumen igual de medio completo y transfiera la suspensión celular de cada pozo a tubos individuales para la centrifugación. Después de retirar cuidadosamente los sobrenadantes, resuspender los pellets en un mililitro de PBS por tubo para una segunda centrifugación y retirar los sobrenadantes de nuevo. Para extractos de proteínas totales, incubar los gránulos durante 30 minutos sobre hielo en 50 a 100 microlitros de tampón de lelisis complementados con inhibidores de la proteasa y la fosfatasa.
Al final de la incubación, centrifugar el extracto a 16.000 veces g durante 15 minutos y cuantificar la concentración de proteínas mediante cualquier ensayo de cuantificación estándar. A continuación, mezcle 20 microgramos de cada muestra de proteína con cinco microlitros de tamplio 4X Deemmli a un volumen total de 20 microlitros y hierva las muestras a 100 grados celsius durante cinco minutos. Para fraccionamiento subcelular, resuspender las células en medio completo para contar y girar hacia abajo una vez 10 a las seis células por muestra.
Para aislar la fracción citosólica, incubar los gránulos en 100 microlitros de tampón de extracción citoplasmática helada complementado con inhibidores de la proteasa a cuatro grados Centígrados con mezcla suave durante 10 minutos. Al final de la incubación, recoger las muestras por centrifugación y transferir los sobrenadantes en tubos pre-refrigerados. Añadir 100 microlitros de tampón de extracción de membrana fría con hielo complementado con inhibidores de la proteasa al pellet para una incubación de 10 minutos a cuatro grados Celsius con mezcla suave.
Luego centrifuga los pellets durante cinco minutos a cuatro grados Celsius y 3.000 veces g y recoger los sobrenadantes en nuevos tubos. Para recoger la fracción nuclear soluble, añadir 50 microlitros de tampón de extracción nuclear complementados con inhibidores de la proteasa a los pellets con vórtice antes de incubar las muestras a cuatro grados centígrados durante 30 minutos. Al final de la incubación, centrifugar las muestras y recoger los sobrenadantes.
Para recoger la fracción nuclear insoluble, añadir 50 microlitros de tampón de extracción nuclear complementados con inhibidores de la proteasa, cloruro de calcio y nucleasa micrococal a los pellets con vórtice. Incubar las muestras durante cinco minutos a 37 grados centígrados antes de vórtice y centrifugar. A continuación, recoger los sobrenadantes.
Para recoger la fracción citoesquelética, añadir 50 microlitros de tampón de extracción citoesquelética complementados con inhibidores de la proteasa a los gránulos con vórtice. Después de una incubación de 10 minutos a temperatura ambiente, centrifugar las muestras y recoger los sobrenadantes. Para el análisis SDS-PAGE, agregue siete microlitros de tampón 4X Laemmli a 20 microlitros de cada una de las muestras de fracción subcelular recogidas y hierva las muestras a 100 grados celsius durante cinco minutos.
Al final de la incubación, cargue las muestras en un gel de acrilamida y realice la electroforesis a una tensión constante de 120 voltios. Luego transfiera las proteínas a una membrana de nitrocelulosa a 250 miliamperios durante 90 minutos. Incubar la membrana durante cinco minutos en la solución de tinción de Ponceau para comprobar si hay electroforesis de gel proteico adecuada y una hinchazón exitosa.
Al final de la incubación, enjuague la membrana en agua destilada hasta que el fondo esté limpio y retire la mancha con un lavado continuo con solución salina tamponada Tris complementada con Tween 20 durante 10 minutos en una coctelera. A continuación, incubar la membrana con solución de bloqueo durante una hora a temperatura ambiente con agitación antes de lavar tres veces con solución salina tamponada Tris más Tween 20 durante cinco minutos por lavado. Después del último lavado, hibrida la membrana con el anticuerpo primario de interés en bloquear la solución durante la noche a cuatro grados Celsius seguido de tres lavados con solución salina tamponada Tris más Tween 20 durante cinco minutos.
Después del último lavado, hibrida la membrana con un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante adecuado en solución de bloqueo durante una hora a temperatura ambiente antes de lavar la membrana con solución salina tamponada Tris más Tween 20 tres veces durante cinco minutos por lavado. Después del último lavado, detecte la banda de proteínas usando quimiuminescencia y cuantifique la intensidad de las bandas Western Blot de ImageJ. En ausencia de ácido retinoico y factor neurotrófico derivado del cerebro, las células SH-SY5Y indiferenciadas asumen una morfología más redonda y forman grumos celulares.
Como era de esperar, después de cinco días de tratamiento con ácido retinoico, los grumos se relajan y las células se extienden. Después de tres días adicionales de tratamiento con factor neurotrófico derivado del cerebro, las células aparecen uniformemente distribuidas e interconectadas a través de una red de neuritas ramificadas. Después de la transfección tau-NLS o tau-NES, la localización subcelular tau se puede detectar mediante inmunofluorescencia con anticuerpos anti-tau.
Dependiendo de la eficiencia de la transfección, las células muestran una fuerte tinción nuclear fusionándose con la señal DAPI después de la transfección tau-NLS o una tinción citoplasma con los núcleos vacíos después de tau-NES. El análisis de Western Blot revela el enriquecimiento de la actina dentro de la fracción citoesquelética, la tubulina dentro de las fracciones citoplasmáticos y citoesqueléticas, y el H2B dentro de las fracciones nucleares. El análisis de Western Blot también confirma la expresión de tau etiquetado y sin etiquetar dentro del compartimiento nuclear y del transportador de glutamato vesicular una expresión en el extracto total.
De hecho, la proporción de tau en las fracciones nucleares y citoplasmáticos solubles pone de relieve el hecho de que el tau-NLS está altamente enriquecido en la fracción nuclear soluble, mientras que el tau-NES disminuye. Además, el tau-NLS se enriquece en la fracción ligada a la cromatina con respecto a la fracción citoplasmática, mientras que el tau-NES disminuye. Asegúrese de comprobar cuidadosamente el número de células utilizadas para el fraccionamiento de cada muestra y verificar el enriquecimiento de los genes de limpieza en las fracciones adecuadas.
Después de ver este video, usted debe ser capaz de aislar los compartimentos celulares y evaluar el papel funcional del tau en el núcleo.
