Este protocolo describe tres ensayos in vitro que evalúan colectivamente las funciones de las células endoteliales periventriculares humanas y su interacción con las interneurones GABAérgicos humanos. Los resultados de estos ensayos proporcionarán una visión crítica del vínculo entre las células endoteliales periventriculares y los trastornos cerebrales. Estos ensayos son simples, de bajo costo y permiten la medición de la migración celular en el rango de centímetros, lo que no se logra mediante otros ensayos existentes.
Los defectos en la migración y distribución de las interneuriones GABAérgicas se asocian con trastornos psiquiátricos, como autismo, epilepsia, esquizofrenia y depresión. Por lo tanto, es fundamental estudiar la interacción de células endoteliales periventriculares con interneuriones GABAérgicos en el contexto humano para abordar la patogénesis de estos trastornos. Comience preparando células humanas para el ensayo.
Permita que las células endoteliales periventriculares humanas alcancen entre el 70 y el 80% de confluencia y luego las disocian de acuerdo con las instrucciones del manuscrito y las cuenten usando el método de exclusión azul trypan. Para preparar interneuriones GABAérgicos humanos, solución de disociación de células cálidas y una alícuota de medio neuronal a 37 grados centígrados durante 10 minutos. A continuación, aspirar el medio de cada pozo que contiene las células y lavarlas con un milímetro de PBS por pozo.
Separe las células añadiendo 0,5 mililitros de solución de disociación preadisa por pozo e incubando a 37 grados centígrados durante cinco minutos. Después de la incubación, añadir un mililitro de medio neuronal por pozo y transferir la solución celular a un tubo cónico de 15 mililitros, triturando suavemente a grumos celulares disociados. Centrifugar las células a 380 veces G durante cinco minutos a temperatura ambiente, aspirar el sobrenadante y resuspender el gránulo celular en un mililitro de medio neuronal.
A continuación, cuente las celdas vivas mediante la exclusión azul trypan. Preparar el control de las células endoteliales humanas calentando la solución de disociación celular y una alícuota de medio endotelial a 37 grados centígrados, 10 minutos antes de su uso. Aspirar el medio de cada pozo y lavarlos con un mililitro de PBS por pozo.
Separe las células añadiendo 0,5 mililitros de la solución de disociación preadisa a cada pozo e incubando la placa a temperatura ambiente durante cinco minutos. Luego, agregue un mililitro de medio celular endotelial por pozo para neutralizar la solución de disociación, y transfiera las células a un tubo cónico de 15 mililitros. Centrifugar las células a 200 veces G durante cinco minutos, aspirar el sobrenadante y resuspender las células en un mililitro de medio celular endotelial.
A continuación, utilice el método de exclusión trypan para contar las celdas. Prepare un inserto de cultivo de pozo cortando tres lados de un pozo de un inserto de cultivo de silicona de dos pozos con una cuchilla estéril. Retire el inserto con pinzas estériles y colóquelo en el centro de una placa recubierta de poli-L-ornitina y laminina, luego presione a lo largo del borde de la plaquita para fijarla a la superficie.
Gire cuidadosamente el plato boca abajo para verificar que la plaquita está firmemente adheridas, y marque el límite del compartimiento de la plaquita utilizando un mercado negro permanente con una punta ultra fina. Suspenda las interneurones GABAérgicos humanos en células endoteliales periventriculares medianas neuronales y humanas y el medio celular endotelial a una concentración de 30.000 por cada 70 microlitros, luego sembrar 70 microlitros de la solución celular dentro de cada inserción de cultivo de pozo. Agregue un mililitro de medio neuronal a la antena de neurona para llenar el área alrededor de la plaquita y evitar que el recubrimiento se seque.
Del mismo modo, agregue un mililitro de medio celular endotelial a la placa celular endotelial periventricular. Revise las células bajo un microscopio para verificar que no están goteando del compartimiento de la plaquita, luego incubarlas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 24 horas. Después de la incubación, revise las células de nuevo bajo el microscopio para verificar que se han adherido correctamente.
48 horas después de la siembra, retire suavemente el inserto con pinzas estériles y compruebe las células bajo el microscopio para verificar que la capa celular permanece intacta. Retire el medio de la neurona y de los platos de células endoteliales periventriculares, y agregue un mililitro de medio fresco a cada plato. Incubar las células a 37 grados centígrados y 5% dióxido de carbono durante cinco días.
Luego, retire el medio, fije las células con 4%PFA durante 10 minutos y lávelas tres veces con PBS. Para realizar el ensayo de co-cultivo, suspenda 30.000 interneuriones GABAérgicos y 30.000 células endoteliales periventriculares humanas en 70 microlitros de medio de co-cultivo, luego sembrar esta solución celular dentro de un compartimiento de inserción de un pozo. Después de 48 horas, retire el inserto.
Incubar el co-cultivo a 37 grados centígrados y 5% dióxido de carbono durante cinco días. Después de la incubación, retire el medio, fije las células con 4%PFA y lávelas tres veces con PBS. Para realizar el ensayo de atracción de quimio, coloque un inserto de cultivo de tres pozos en el centro de un plato de 35 milímetros recubierto de poli-L-ornitina y laminin, gire el plato boca abajo y marque el límite alrededor del compartimento central de la plaquita usando un marcador permanente con una punta ultra fina.
Semilla 30.000 interneurones GABAérgicos en 70 microlitros de medio neuronal en el compartimento medio, luego siembra 10.000 células endoteliales periventriculares y 10.000 células endoteliales de control y 70 microlitros de sus respectivos medios en los dos compartimentos exteriores. Agregue un mililitro de co-cultivo medio a lo largo del lado de la placa para evitar que el recubrimiento en el plato se seque. Después de 48 horas, retire el inserto e incubar las células a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 36 horas.
Después de la incubación, retire el medio, fije las células y lávelas tres veces con PBS. Se utilizaron ensayos de migración de larga distancia y co-cultivo para investigar las interacciones entre las células endoteliales periventriculares y las neuronas GABAérgicas. En el ensayo de migración de larga distancia, las celdas comenzaron como un parche rectangular en el día cero, pero en 48 horas, habían migrado hacia el espacio libre de celdas.
La tinción inmunocitoquímica con anticuerpos caspasa-3 antiactivos, un marcador de apoptosis, no mostró ninguna señal apoptótica en las neuronas de las semillas. En el ensayo de migración de co-cultivo, cuando las interneuriones fueron co-sembradas con células endoteliales periventriculares humanas, las neuronas recorrieron distancias más lejos en comparación con cuando las interneurones se siembran solas o cuando se co-sembraron con células endoteliales de control. En el ensayo quimio-atracción, un número significativamente mayor de interneurones migró hacia las células endoteliales periventriculares en comparación con el control de las células endoteliales, confirmando que las interneuriones GABAérgicas responden selectivamente a señales quimio-atractivas secretadas por células endoteliales periventriculares.
Estos ensayos se pueden modificar utilizando ligandos, inhibidores o análisis de arenes para obtener información mecanicista sobre las interacciones de las células endoteliales periventriculares humanas con interneuriones humanos. También se pueden utilizar para estudiar la interacción de células endoteliales periventriculares humanas con otras células neuronales según lo informado por nuestro grupo y otros. Al intentar este procedimiento, es importante fijar la plaquita firmemente en el plato y mantenerla intacta durante todo el ensayo, de lo contrario puede conducir a fugas de celda, desprendimiento de celdas o desalineación de la plaquita con el límite dibujado.
Nuestro trabajo ha indicado el papel autónomo celular de las células endoteliales periventriculares humanas en la patogénesis de trastornos psiquiátricos como la esquizofrenia, la epilepsia y el autismo. Por lo tanto, estos ensayos permitirán evaluar las células endoteliales periventriculares enfermas derivadas de pacientes con estos trastornos que utilizan la tecnología IPSC.
