Hemos desarrollado un protocolo robusto en el que se pueden realizar múltiples rondas de hibridación in situ en el mismo cerebro de Drosophila, lo que permite la visualización de los patrones de expresión de muchos genes diferentes. La incrustación del cerebro de la mosca en un hidrogel garantiza una excelente integridad del tejido y la estabilidad del ARNm durante múltiples rondas de hibridación. También mejora significativamente la claridad óptica al obtener imágenes.
EASI-FISH puede ser adoptado por cualquier laboratorio con un microscopio confocal o de lámina de luz para definir los perfiles de expresión génica de los tipos de células en el cerebro de la mosca. Para comenzar, limpie un portaobjetos no cargado con un reactivo de descontaminación de ARN. Retire la película opaca que protege el adhesivo de la junta de silicona.
A continuación, adhiera la junta que contiene hasta cuatro cámaras a la corredera. Utilice una pipeta P20 para recubrir cada superficie de la cámara con un microlitro de polilisina. A continuación, transfiera hasta cuatro cerebros de Drosophila por tubo a un tubo de PCR de 0,2 mililitros.
Rehidratar el cerebro en 150 microlitros de PBS que contengan 0,1%Triton X-100 seguido de PBS. Agregue 40 microlitros de PBS en cada cámara. Con un par de pinzas finas, coloque suavemente los cerebros en una fila en el centro de la cámara, dejando algo de espacio entre ellos.
Retire el PBS de la cámara y agregue inmediatamente 50 microlitros de tampón MOPS de 20 milimolares. Mientras los cerebros se equilibran en el tampón MOPS, pipetee volúmenes iguales de Melphalan-X descongelado en un tubo con tampón MOPS de igual volumen. A continuación, añada la solución madre Ac-X en una proporción de uno a 100.
Agita la solución y gírala brevemente para recogerla. Retire todo el tampón MOPS de las cámaras y agregue 50 microlitros de la solución Melphalan-X Ac-X. Coloque un cubreobjetos en la parte superior de cada cámara sin usar el adhesivo de la junta para sellar.
A continuación, coloque la cámara en una caja humidificada. Al día siguiente, retire con cuidado el cubreobjetos y aspire la solución Melphalan-X Ac-X. Lave los cerebros montados dos veces en 100 microlitros de 0,1% de PBT, seguidos de 100 microlitros de PBS.
Coloque soluciones descongeladas de TREx-1000 4-Hydroxy-TEMPO, TEMED y persulfato de amonio sobre hielo. Agite la solución TREx-1000 para asegurarse de que no haya precipitado. Mezcle las soluciones para preparar una solución de gel y vórtice antes de glasear.
Con una punta de pipeta, retire el PBS de la cámara y absorba cualquier líquido residual con una toallita sin pelusa. Agregue inmediatamente 40 microlitros de solución de gel sobre los cerebros en cada cámara. Incubar las cámaras a cuatro grados centígrados durante 10 minutos.
Ahora retire la solución de gel de la cámara. A continuación, retire la película protectora transparente del adhesivo de la superficie de la junta. Agregue 45 microlitros finales de solución de gel fresco.
Coloque suavemente un cubreobjetos sobre la cámara y presione el cubreobjetos para sellar la cámara antes de incubar a cuatro grados centígrados durante otros 10 minutos. Incubar la cámara a 37 grados centígrados durante 1,5 horas para polimerizar el gel. Después de enfriar los geles en un banco, use una cuchilla de afeitar para quitar con cuidado el cubreobjetos y la junta de silicona.
Recorta el gel en forma rectangular y corta la esquina superior derecha para indicar la orientación de la muestra. A continuación, utilice un pincel fino humedecido con una pequeña cantidad de tampón Pro K para levantar con cuidado los geles del portaobjetos. Transfiera cada gel individualmente a un tubo de microcentrífuga de dos mililitros.
Mezcle 500 microlitros de tampón Pro K y cinco microlitros de enzima proteinasa K, y agregue la mezcla a cada gel. Incubar a 37 grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, retire el tampón con una pipeta fina y flexible y luego lave los geles tres veces en PBS durante 10 minutos cada uno.
Incubar los geles durante 30 minutos en un mililitro de tampón DNASE1 a 37 grados centígrados. Mezcle 50 microlitros de enzima DNASE1 con 450 microlitros de tampón DNASE1. Mezclar suavemente sin vórtice.
Incubar cada gel en 500 microlitros de solución de DNASE1 durante dos horas a 37 grados centígrados. Luego, lave los geles cuatro veces durante 15 minutos con un mililitro de PBS a temperatura ambiente. Ahora, incubar los geles en 500 microlitros de tampón de hibridación descongelado sin sondas durante 30 minutos a 37 grados centígrados.
Diluir las sondas en tampón de hibridación en una proporción de uno a 100, preparando 300 microlitros por gel. Incubar los geles con tampón de hibridación que contenga sondas durante la noche a 37 grados centígrados. Al día siguiente, lave los geles primero en tampón de lavado con sonda y luego en PBS.
Para la reacción en cadena de hibridación, agregue 500 microlitros de tampón de amplificación al gel e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente. Caliente las horquillas fluorescentes a 95 grados centígrados durante 90 segundos en una máquina de PCR y enfríe la solución a 25 grados centígrados durante 30 minutos. Para cada sonda, diluya los pares de horquillas correspondientes en una proporción de uno a 50 en tampón de amplificación, preparando 300 microlitros por gel.
Después de vorticear la mezcla, agregue la mezcla a los geles e incube. Para montar el gel para la obtención de imágenes de láminas ligeras, cubra la superficie de fijación del gel de un soporte de gel dos veces con un microlitro de polilisina, dejándolo secar a 37 grados centígrados entre capas. Luego, coloque el gel en un cubreobjetos de modo que el corte quede en el lado izquierdo.
Con un pincel, transfiera el gel sobre la superficie tratada con un solo movimiento. Los genes asociados a neurotransmisores y los genes de neuropéptidos exhibieron distintos patrones de expresión en el cerebro adulto de Drosophila. VGluT y Gad1 se detectaron conjuntamente en la misma ronda de hibridación, mostrando patrones de expresión no superpuestos.
AstA mostró una expresión fuerte en el lóbulo óptico y una expresión más débil en el complejo central. Crz se expresó altamente en la pars lateralis, mientras que se observaron niveles de expresión más bajos en las neuronas del lóbulo óptico. Tk se detectó en neuronas H delta D identificadas con expresión de Mer-GFP utilizando una línea GAL4 dividida específica mediante microscopía de lámina de luz o confocal.
FMRFamida estuvo ausente en las neuronas PFG marcadas por Mer-GFP, pero se detectó en las neuronas circundantes. Las imágenes de alta resolución de las neuronas FB4K confirmaron la distribución espacial de las transcripciones VGluT y ChAT/VAChT. Los neuropéptidos, como AstA y Crz, se expresan tan alto en algunas células que ya no se pueden separar las manchas fluorescentes individuales que representan transcripciones individuales.
