Nuestra investigación evalúa los comportamientos de acicalamiento en Drosophila melanogaster después de la reducción de Atg8a mediada por ARNi para modelar los déficits de GABARAP observados en pacientes con síndrome de Tourette. Nuestro objetivo es comprender el papel de aAtg8a en el desarrollo del comportamiento, proporcionando información sobre las funciones reguladoras de su contraparte humana en los procesos neuroconductuales. Los desafíos experimentales actuales con el método de anotación manual incluyen el complejo proceso analítico, como la anotación y la revisión de imágenes, y la subjetividad involucrada en la anotación manual.
Los métodos automatizados también enfrentan desafíos, incluido el requisito de conocimientos sustanciales en ciencias de la computación para implementarlos y ejecutarlos de manera efectiva. Hemos encontrado que el gen Atg8a juega un papel en el desarrollo del comportamiento en las moscas de la fruta más allá de lo que se ha establecido anteriormente. Más específicamente, encontramos que regula tanto el aseo como el aprendizaje, lo que sugiere que los ortólogos Atg8a pueden desempeñar funciones similares en otros organismos.
Esta técnica permite la cuantificación directa de la frecuencia y distribución del acicalamiento en Drosophila. Es especialmente útil en laboratorios que no pueden utilizar métodos automatizados y permite un análisis más detallado que los métodos indirectos basados en colorantes. En general, nuestra investigación avanza en el uso de Drosophila como organismo modelo para estudiar los trastornos del neurodesarrollo que exhiben un comportamiento obsesivo-compulsivo, como el síndrome de Tourette.
También se suma a la creciente evidencia de que las proteínas relacionadas con la autofagia desempeñan un papel en el desarrollo del comportamiento. Para comenzar, coloque cuatro platos de tres pocillos uno al lado del otro sobre una superficie blanca y cubra cada plato con un portaobjetos de vidrio. Coloca una cámara encima de los platos.
Asegúrese de que no haya deslumbramiento en los portaobjetos que pueda limitar la visibilidad de las moscas en el plato y ajuste la posición del plato o atenúe las luces según sea necesario para eliminar el deslumbramiento. Ahora marque la posición de los platos y la cámara en el banco donde se está realizando la grabación. Coloque moscas de cuatro a nueve días de edad en un bloque de hielo cubierto con parafilm y una toalla de papel para anestesiarlas ligeramente.
Una vez anestesiadas, traslade las moscas a las cámaras de observación lo más rápido posible con un pincel. Coloque una mosca en cada pocillo del plato de tres pocillos, asegurando una perturbación mínima para evitar provocar cambios de comportamiento inducidos por el estrés. Después de aclimatar las moscas 30 minutos después de la anestesia, grabe las moscas con una cámara, luego abra el terminal y escriba cd PiSpy.
Escribe python3 PiSpy. py, e introduzca la duración de grabación y la velocidad de fotogramas deseadas. Seleccione la resolución deseada y haga clic en Captura rápida.
Ahora use la función de vista previa de la cámara en Pi Spy para asegurarse de que las moscas estén enfocadas y sean lo suficientemente visibles. Grabe las moscas durante 10 minutos a una velocidad de fotogramas recomendada de 24 fotogramas por segundo y guarde el archivo. Para analizar el video, importe el archivo en el software ELAN 6.8 para obtener anotaciones detalladas y un análisis en profundidad de los comportamientos de acicalamiento.
Seleccione Nivel, Agregar nuevo nivel, escriba ubicación en el plato en el nombre del nivel y agregue para asignar cada fila para anotar las imágenes de las personas manualmente. Para anotar comportamientos, haga doble clic en el nivel que desea anotar, haga clic con el botón derecho y arrastre el cursor a lo largo del nivel seleccionado durante un período durante el cual se muestra un solo episodio de acicalamiento. Haga clic con el botón izquierdo para seleccionar una nueva anotación y haga doble clic en el período de tiempo recién resaltado para escribir la abreviatura del comportamiento observado en ese momento.
Una vez que el video esté completamente anotado, obtenga un desglose de cada comportamiento haciendo clic en Ver, seguido de Estadísticas de anotación. Identifique el acicalamiento anterior como el acicalamiento realizado en la región anterior del cuerpo de la mosca. Identifique el acicalamiento posterior como el acicalamiento realizado en el extremo antero-posterior del cuerpo de la mosca.
Los episodios de acicalamiento aumentaron significativamente en los mutantes de ARNi Atg8a en comparación con los grupos de control. El tiempo dedicado al acicalamiento también fue significativamente elevado en los mutantes de ARNi Atg8a en comparación con los controles. No se observaron diferencias significativas en la distribución de las conductas de acicalamiento anterior frente a posterior.
