Nuestro laboratorio utiliza la mosca de la fruta como organismo modelo para estudiar cómo se procesa la información del sabor a través de circuitos neuronales, desde la detección de sustancias químicas hasta el impacto en el comportamiento. Estamos utilizando este protocolo de imágenes para identificar las células gustativas que responden a los aminoácidos y determinar si los diferentes estados internos modulan la forma en que las células gustativas responden a estos nutrientes esenciales. Una ventaja de este enfoque de imágenes de calcio es que permite registrar las respuestas neuronales inducidas por el gusto a partir de células específicas en animales despiertos donde los estados internos permanecen intactos.
Ahora podemos identificar circuitos gustativos putativos en el nuevo conectoma cerebral completo de Drosophila y verificar la dinámica neuronal funcional in vivo utilizando este enfoque de imágenes de calcio. Para comenzar, coloque la mosca anestesiada bajo un microscopio de disección. Con unas tijeras de disección, retire las patas medias y traseras en la articulación tibial femoral y las cuatro patas en el trocánter.
Levante la mosca por las alas con pinzas romas para colocarla con la cabeza por encima de la ranura del cuello uterino objetivo de la cámara de imágenes mientras mantiene el cuerpo debajo. Con el lado romo de las tijeras y las pinzas romas, empuje suavemente la cabeza y el tórax simultáneamente en la ranura. Una vez que la mosca esté segura dentro de la ranura, empújela hacia atrás y vuelva a colocarla suavemente para que mire hacia el frente de la cámara.
Reúna una pequeña gota de esmalte de uñas en el extremo de un palillo de dientes y aplique una capa delgada para asegurar la cabeza de la mosca a la cámara de imágenes. Levanta la cerera con una mano y recoge una pequeña gota de cera en la punta. Con pinzas semiafiladas, en la otra mano, agarre un palpo maxilar y tire suavemente y sostenga la probóscide en extensión completa.
Toque la punta de la cerera con la cámara cerca de la base de la probóscide hasta que la cera comience a fluir. Mueva para hacer contacto con la base de la probóscide y encera a la mitad del eje, evitando el contacto con los sensililos de la etiqueta. A continuación, extienda completamente la probóscide lo más recta posible.
Ahora coloque las moscas montadas en una cámara de humedad durante 60 minutos para que se recuperen. Retire las moscas de la cámara de humedad. Con unas pinzas muy afiladas, pellizque ambas antenas, pellizque la cutícula para crear un agujero e inserte un lado de las pinzas afiladas.
Pasa las pinzas por debajo de la cutícula para extraerla de la región que cubre el área cerebral de interés. Para lavar el cerebro expuesto, agregue aproximadamente 100 microlitros de solución de hemolinfa artificial, o AHL, a la cabeza. Después del lavado, retire el AHL, dejando una capa delgada para evitar que el cerebro se seque.
Con pinzas afiladas, retire las bolsas de aire y cualquier residuo grande que cubra el cerebro. Para obtener una imagen específica de la zona subesofágica, o SEZ, corte el esófago en la base cerca de la probóscide y en el punto donde pasa a través del cerebro, utilizando pinzas muy afiladas. Retire esta pieza para exponer la ZEE.
Bajo el microscopio de disección, coloque el cubreobjetos de 10 por 20 milímetros en la ranura angular de la cámara de imágenes. Cargue aproximadamente dos microlitros de agua, u otro control negativo, en el tubo capilar. Localice la mosca disecada y concéntrese en el labelo utilizando un objetivo de campo claro de inmersión en aire 10x.
Alinee el capilar con el labelo bajo la vista de 10x. Deje la posición capilar directamente delante del labelo, asegurándose de que esté cerca pero sin tocarse. Mueva el escenario para centrar la región del cerebro de interés.
Cambie a un objetivo de inmersión en agua de mayor aumento, como el objetivo de 40x. Agregue aproximadamente 200 microlitros de AHL en la parte superior del cerebro para asegurar el contacto con el objetivo de inmersión. Cambie a una potencia láser de 488 nanómetros para localizar la expresión de GCaMP en el área de interés.
Después de recolectar al menos cinco segundos de fluorescencia basal, mueva manualmente el estimulador para que el capilar cubra el labelo durante cinco segundos. Retira el estímulo y continúa capturando todo el tiempo que desees. A continuación, retire el AHL y vuelva a un campo claro de 10x para confirmar que el cubreobjetos, el estimulador y el labelo permanecen en la posición correcta.
A continuación, retire la cámara de imagen y utilice una toallita sin pelusa para extraer la primera solución del capilar. Enjuague la pipeta con agua y pipetee aproximadamente dos microlitros del siguiente sabor en el tubo capilar. El cambio relativo de fluorescencia en las moscas Gr64f GCaMP fue significativamente mayor para la estimulación con sacarosa en comparación con el agua, lo que demuestra una respuesta fuerte y sostenida de las neuronas receptoras gustativas dulces.
El pico relativo de fluorescencia para la estimulación con sacarosa fue significativamente mayor que el del agua. El cambio de fluorescencia en las moscas Gr66a GCaMP fue significativamente mayor para la estimulación con cafeína que para el agua, mostrando respuesta al inicio y eliminación de la cafeína. El patrón de proyección de los terminales axónicos en las moscas Gr66a fue distinto al de Gr64f, lo que demuestra la segregación anatómica de las neuronas receptoras gustativas amargas y sensibles al azúcar.
