Estudiamos las interacciones entre los receptores tirosina quinasas y la membrana plasmática de los mamíferos. Queremos saber cómo las balsas lipídicas y la asimetría lipídica impulsan la localización, activación y señalización de los receptores. Es un desafío estudiar las balsas de lípidos directamente porque son pequeñas, dinámicas y sensibles a las condiciones de temperatura.
Los investigadores a menudo tienen que usar sistemas modelo con dominios de orden grande para estudiar las interacciones. Las vesículas sintéticas y de membrana plasmática son representaciones imperfectas de membranas celulares que carecen de asimetría lipídica y orgánulos. Al trabajar con células vivas, logramos una representación precisa de la membrana plasmática.
Destacan el inicio de la señalización de receptores en el contexto de células vivas. Esto da una idea del efecto de los entornos de membrana en los receptores y sus vías de señalización posteriores. Para empezar, alícuota el stock lipídico en un tubo de borosilicato utilizando una pipeta de desplazamiento positivo con punta de vidrio.
Coloque el tubo de borosilicato en un bloque calefactor ajustado a aproximadamente 50 grados Celsius y aplique un chorro de gas nitrógeno al tubo hasta que se evapore todo el cloroformo aparente. Transfiera el tubo a una cámara de vacío y expóngalo a un alto vacío durante una hora para eliminar cualquier solvente restante. A continuación, añada el medio F-12 de Ham sin suero a la película lipídica seca para alcanzar una concentración final de 20 milimolares.
Cubra el tubo con una tapa o cinta de teflón y caliéntelo en un baño de agua a 70 grados centígrados durante cinco minutos. A continuación, vórtice la solución para suspender los lípidos y formar vesículas multilaminares o MLV. Después de que el medio se vuelva turbio, transfiera todo el volumen a un tubo de microcentrífuga y guárdelo a cuatro grados centígrados durante un máximo de tres días.
Mezcle los MLV preparados con metil alfa ciclodextrina hasta una concentración final de 40 milimolares. Incube la mezcla de lípidos durante 30 minutos en un baño de agua a 37 grados centígrados o 55 grados centígrados. Observe la transición de los medios de nublado a claro.
Luego, deje que el medio de intercambio de lípidos se enfríe a temperatura ambiente durante 30 a 60 minutos. Obtenga células receptoras de insulina de ovario de hámster chino cultivadas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono en DMEM suplementado que contiene 4,5 gramos por litro de glucosa. Siembre 1,5 veces 10 a la potencia de seis células en placas de 60 milímetros e incube para obtener una confluencia del 80 al 90%.
Luego, lave las células tres veces con un mililitro de PBS. Prive a las células durante la noche con dos mililitros de medios F-12 de Ham sin suero. Después de lavar las células tres veces con PBS, agregue un mililitro del medio de intercambio preparado.
Incubar las células durante una hora a temperatura ambiente, agitándolas cada 15 minutos para garantizar una exposición uniforme a los medios de intercambio. Luego, lave las células tres veces con un mililitro de PBS. Retire completamente el PBS de la placa de cultivo celular y colóquela en un ángulo de 45 grados durante 10 minutos o hasta que esté completamente seca.
Después de eliminar el tampón residual, agregue un mililitro de una solución de isopropanol de hexano a las células secas e incube durante 10 minutos en un agitador a temperatura ambiente. Ahora transfiera la solución a un tubo de borosilicato. Después de cubrir el tubo, guárdelo a menos 20 grados centígrados.
A continuación, disuelva los restos celulares restantes utilizando 500 microlitros de un hidróxido de sodio normal. Agite el recipiente durante 10 minutos a temperatura ambiente para asegurar una disolución completa. Para verificar la eficiencia del intercambio, vierta 100 mililitros de una solución de hidróxido de amonio al 30% de metanol con cloroformo en un tanque de cromatografía de capa fina de vidrio.
Cubra bien el tanque y deje que el vapor se equilibre durante al menos una hora. Seque la muestra de extracto lipídico en un bloque calefactor a baja temperatura bajo una corriente de gas nitrógeno hasta que el solvente orgánico se evapore. Luego, disuelva la película lipídica en 50 microlitros de una solución de metanol de cloroformo uno a uno.
Con una jeringa Hamilton de 10 microlitros, cargue de uno a 10 microlitros de la muestra en una placa TLC de sílice de alto rendimiento. Aplique la muestra en bandas de un centímetro cargando un máximo de 10 bandas por placa de 20 centímetros. Coloque la placa TLC en posición vertical en el tanque TLC y permita que el frente del solvente viaje ocho centímetros para separar las especies de fosfolípidos.
A continuación, deje que la placa se seque durante 10 minutos y rocíela con una solución acuosa de acetato cúprico al 3% y ácido fosfórico al 8%. Deje que la placa se seque nuevamente durante 30 minutos a temperatura ambiente o con una pistola de calor. La placa debe cambiar de azul translúcido a blanco opaco.
A continuación, carbonice la placa en un horno templado a 180 a 200 grados centígrados durante 5 a 10 minutos, o hasta que se vean bandas lipídicas negras. Incubar las células tratadas con 500 microlitros de insulina de 100 nanomolares en medios libres de suero durante cinco minutos a temperatura ambiente. Después de lavar las células con PBS helado, colóquelas sobre hielo para detener la estimulación.
Luego agregue un mililitro de PBS helado y coseche las células con un raspador de celdas. Granular las células a 3000 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. A continuación, agregue de 100 a 200 microlitros de tampón de lisis RIPA completo al pellet de celdas y resuspenda de 30 a 40 veces para lisar las celdas.
Después de incubar el lisado en hielo durante 10 minutos, centrifugue a 16.000 g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados para separar los residuos. Recoja el sobrenadante en un tubo nuevo. Después de determinar la concentración de proteína, mezcle el lisado con tampón cinco veces laemmli y caliéntelo a 95 grados centígrados durante cinco minutos.
Cargue cantidades iguales de proteína por muestra en un gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sodio para la electroforesis. Haga funcionar el gel a 100 a 150 voltios en un tampón de funcionamiento hasta que las proteínas se resuelvan bien entre 100 y 250 kilodaltons. A continuación, transfiera las proteínas resueltas a una membrana de fluoruro de polivinilideno utilizando un tampón de transferencia y tiña la membrana con los anticuerpos adecuados.
El intercambio de lípidos en las células IR del ovario del hámster chino dio lugar a un aumento de la intensidad de la banda de esfingomielina y una disminución de la intensidad de la banda de fosfatidilcolina cuando se intercambió esfingomielina cerebral. Por el contrario, cuando se intercambió 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina o DOPC, la intensidad de la banda de fosfatidilcolina aumentó, mientras que la intensidad de la banda de esfingomielina disminuyó. Las células intercambiadas con DOPC mostraron una disminución en la autofosforilación de IR dependiente de insulina.
Por el contrario, las células intercambiadas por esfingomielina cerebral mantuvieron o aumentaron moderadamente la fosforilación de IR. Los niveles normalizados de fosforilación se determinaron dividiendo la intensidad de IR de pYpY por la intensidad beta de IR a partir de los datos de Western blot.
